质粒DNA提取与限制性内切酶酶切鉴定
一、实验目的和应用价值
为了检验大肠杆菌质粒是否有目的基因，我们先要用碱法提取出高纯度的大肠杆菌质粒DNA并且进行限制性核酸内切酶酶切，然后，我们要进行酶切产物的电泳以及紫外线分光光度法检测DNA。目前这些技术已经广泛应用于基因克隆技术的检验克隆产物阶段。
二、实验原理
(1)首先利用质粒DNA和染色体DNA分子量的差异来进行的。质粒小，为双链、闭环的超螺旋DNA分子，复性容易，而染色体DNA大，不易复性，导致这两种DNA提取不同的方法。因而利用碱法提取质粒DNA，先从混合物中分离出来，然后逐步纯化即可得。
(2)限制性内切酶是一组可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的内切酶。
(3)通过琼脂糖凝胶电泳形成的分子筛方法,根据DNA分子大小以及构型不同来分离得到不同的DNA片段.
(4)吸光光度法是基于核酸分子含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，对一定波长的光具有选择性吸收的特性,其吸收强度与核酸浓度成正比。
三、实验基本流程
第一部分
1、将1.5ml大肠杆菌培养液加于EP管，然后以12000rpm×60s离心；
2、弃上清，再重复一次；
3、加入150ul溶液I，充分重悬；
4、加入200ul溶液II，立即、轻柔振荡数次；
5、加入150μl冰溶液III，震荡10s，冰浴3~5min后以12000rpm×10min离心；
6、转移上清到新EP管，分别加入1/2体积酚和氯仿：异戊醇；
7、振荡混匀后以12000rpm×5min离心；
8、转移上清到新EP管，加入等体积的氯仿：异戊醇；
9、振荡混匀，以12000rpm×5min离心；
10、转移上清到新EP管，加入2倍上清体积的无水乙醇混匀，在冰上静置5min以上；
11、以12000rpm×15min离心后弃上清，用100ul70%乙醇洗沉淀，再以12000rpm×2min?离心；
12、弃上清，静置完全干燥后，以20ul的0.1×TE溶解DNA；
13、后取10ul上述溶液加入含母液的管中进行PCR反应,剩下的EP管内的10ul用作对照。
第二部分：琼脂糖电泳
1、制备琼脂糖凝胶板:封板\设置梳子位置与高度\倒胶\凝固后拔梳
2、倒缓冲液:将胶板放在电泳槽中,然后在电泳槽中加入buffer使其淹没胶板
3、以下为加样顺序：5ulMarker/10ul酶解的质粒DNA+2ul上样缓冲液/10ul未酶解的质粒DNA+2ul上样缓冲液；
4、待其差不多到终点时,停止电泳.将胶板取出放在紫外线灯下观察结果.
第三部分：
1、用TE适当稀释待测DNA溶液，记下稀释倍数;
2、TE作为空白,"调0","调100"。
3、测定260nm和280nm的吸收值，计算其比值然后估计纯度。
四、注意事项
1、提取过程中尽量保持低温，在冰中放置的时间可以稍长，以使DNA沉淀完全。
2、操作时要尽量轻
柔，特别是加入溶液II和III后，切忌剧烈震荡，以防止
质粒DNA不可逆变性。
3、使用限制性核酸内切酶时要低温操作，取量要准确，并且要在37℃孵育；使用时，要充分摇匀。
4、酶切时加入的DNA溶液体积不能太大，防止DNA溶液中其它成分会干扰酶反应。
5、在紫外分光光度调零的时候，要先选定波长260nm（样品中RNA浓度）或280nm（样品中DNA浓度）。若数值一直在波动，则表明仪器不稳定，应该立即停止使用。
五、实验结果
1、在质粒酶切电泳中，1孔Marker出现多条带状；2孔已酶切质粒出现双条带状，但是短条带比长条带更明显；而3孔未酶切质粒只有一条带状，并且长度介于已酶切质粒两个条带之间。
2、紫外分光光度中，OD260/280为1.85。
六、实验讨论
1、为什么要在冰中操作？
答：冰中操作是为了防止加入试剂后，质粒DNA不可逆变性。
2、在离心后没有看到沉淀，为什么？
答：可能是反应还不完全，或者反应过多了，导致蛋白质或者DNA的沉淀太少，尽量在低温下多等一会儿然后多离心一次，一般都能看到结果。
3、分离纯化质粒DNA有什么主要过程？
答：①培养细菌使质粒扩增；②裂解细菌，释放质粒DNA；③除去杂质，纯化质粒DNA。
4、影响酶切活性的因素有哪些？
答：①DNA底物：底物的浓度，底物的结构和识别序列的甲基化；②酶切体系：限制酶标准缓冲液组分，酶切温度。
5、质粒酶切电泳的结果有哪些情况？各说明什么？
答：出现的电泳可能有以下几种情况：
M 1 2 3 4
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5-
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10-
1-质粒DNA酶切较完全；2-有一部分质粒DNA被酶切了，而有另一部分无；3-质粒DNA被酶切了，但是另一部分太少，所以显现清楚；4-未酶切的质粒DNA。
6、紫外分光光度的结果说明什么？
答：理论上DNA的OD260/280应该为1.80，但是本次结果为1.85，大于1.80，表明有部分RNA污染；如果出现小于1.80，则表明有蛋白质的污染。
七、总结或感想
我们分离一些物质，可以利用所需物质和其他物质的差别来进行分离，可以先分离出所需物质，再进行纯化；又或者一步步除去其他物质，剩下的所需物质进行纯化。