真菌的分子生物学鉴定方法

第17卷第4期2002年12月邢台师范高专学报

JOURNALOFXINGTAISENORTEACHERSCOLLEGEVol.17.No.4Dec.2002

真菌的分子生物学鉴定方法

于淑玲

(邢台学院,河北邢台 054001)

摘 要:真菌的分子生物学鉴定的方法及原理,真菌DNA碱基组成的分类鉴定、DNA分子杂交、真菌mtDNA限制性片段长度分态性的分析以及随即扩增多态性DNA分析。

关键词:菌株;限制性内切酶;多聚酶链式反应

中图分类号:Q7 文献标识码:A 文章编号:1008-7583(2002)04-0064-02 真菌分类学是一个古老而又传统的学科,也是一个发展中的学科,尤其是近年来真菌分类学引入分子生物学鉴定方法后,在分类方法和分类系统等方面都发生了巨大变化。分类特征是真菌分类的基础。真菌的形态特征复杂,而且少数形态特征和生理生化指标随着环境的变化而不稳定,因此,在传统的真菌分类中常引起分类系统的不稳定或意见分歧。

随着生物化学、遗传学以及分子生物学等相关学科的发展,同时也是真菌分类学自身发展的客观要求,在真菌的现代分类学中引入了分子生物学技术的鉴定方法,例如:DNA碱基组成,限制片段多态性(RFLP),随机扩增多态性DNA(RAPD),脉冲电场凝胶电泳(PFGE),以及小亚基rDNA或(rRNA)序列测定等。

一、真菌DNA碱基组成的分类鉴定方法

DNA由四个碱基组成,即腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C),双链DNA碱基配对规律是A=T和G=C。不同的有机体G+C/A+T的摩尔百分比却各不相同,如果把这四种碱基总相对分子质量看作100,那么真菌DNA的碱基成分可用G+C对全部四个碱基的摩尔百分比(mol%)来表示:(G+C)mol%。

大量的研究表明,脊椎动物DNA(G+C)mol%为35%~45%,细菌为24~78%,真菌为20~60%,真菌的这一宽度与细菌大体相似,这就为这一特征在真菌的分类中的应用提供了基础。

(G+C)mol%在真菌分类鉴定中主要有两种作用:(1)有助于界定真菌的种属。真菌的各种属、纲、门之间都有其特定的DNA(G+C)mol%范围,遗传关系相近的有机体有相似的DNA(G+C)mol%,如果两个菌株之间DNA(G+C)mol%差异较大,可以大致断定它们不是一个种。一般种内(G+C)mol%相差2%以内是无意义的,两个菌株之间(G+C)mol%含量差别在4~5%之间,可以认为是同一种内的不同株;若差别在10~15%之间,可以认为

[收稿日期]2002-05-10

[作者简介]于淑玲(1966 ),女,河北省清河县人,讲师,毕业于河北师大生物系,从事生物教学研究.

是同属内不同种;差别在20~30%之间,则认为是不同属或不同种内真菌。

(2)可以作为判定真菌科属间的亲缘关系的参考标准,但是必须指出,两个菌株的DNA碱基组成相同,而DNA序列上可能有较大的差异,因而两者之间的亲缘关系并不一定相近,因此,(G+C)mol%测定其主要作用在于否定,即(G+C)mol%不相同的菌可以肯定回答它们不是同种,而(G+C)mol%相同的菌就不能肯定回答,只有当它们同时具有大量共同的表型性状时,才能说明它们在遗传学和亲缘关系上相近。

二、核酸分析技术

核酸分析技术目前在真菌分类中应用较多的主要是核糖体脱氧核糖核酸(rDNA),序列测定,DNA分子杂交技术,线粒体DNA限制性片段长度多态性(RFLP)分析,随即扩增多态性(RAPD)技术等。

(一)DNA分子杂交技术

核酸分子杂交技术已广泛应用于遗传学、基因工程及病毒学和细菌学等方面的研究。众所周知,生物体是以DNA的形式通过碱基序列来贮藏遗传信息,不同的生物碱基序列都不同,种的差别越大,其DNA碱基序列差别越大。因此通过不同真菌DNA碱基同源性分析,可以对真菌种属间的亲缘关系做出分析鉴定。

变性的单链DNA在一定条件下,可以靠碱基的配对而复性成双链,这就是DNA杂交的基本原理,同种异株的真菌基因组DNA序列差异较小,一般认定在35%以内,采用示踪物标记的一条DNA分子做探针与另一条DNA片段在适当的条件下杂交,可获得两者间的DNA同源性即杂交百分率,以此判断两菌株是否同属一种。

对于属或属以上的分类鉴定则采用DNA rDNA杂交的方法,因为rDNA在进化的过程中保守性强,用标记的rDNA分别与DNA杂交,可以获得被测DNA分子亲缘关系的资料,核酸分子探针杂交这一技术已日臻成熟,用于真

于淑玲:真菌的分子生物学鉴定方法

菌分类领域的研究近年来已有大量的资料报道,其中关键是真菌核酸分子探针的制备。迄今为止,真菌核酸分子探针大体分为两类,种的特异性探针和多态性探针,从20世纪90年代以来发展迅速,它的应用对真菌分类系统的影响较大。

(二)真菌线粒体DNA限制性片段长度多态性(RFLP)分析

线粒体DNA(mtDNA)是真核生物核外DNA的一种,在分子进化研究中被广泛应用。因为mtDNA为环状而容易提取,且为单拷贝,不含有内含子(intron)和基因间隔区,进化历史简单明了,易于分析。

实际上RFLP分析是对DNA序列分析的一种简化,利用DNA限制性内切酶在特定位置上将DNA切割成不同长度的片段,经电泳分离后,对得到的电泳图谱进行分析比较。限制性内切酶有许多种,每一种能特异性地识别某一段DNA序列。由于在DNA序列中酶切位点的数目和分布

不同,所以酶切后获得的DNA片段的数目和大小也不同。

(三)随即扩增多态性DNA(RAPD)分析

多聚酶链式反应(PCR)的出现为真菌DNA扩增提供了方便且准确的方法。通过(PCR)扩增具有种间特异性的DNA片段从而决定种间的差异。

RAPD分析是一种利用随机合面的单个寡核苷酸引物通过PCR反应扩增靶细胞DNA,扩增的产物通过电泳分析而获得凝胶电泳图谱,分析DNA片段数量和大小的多态性,从而比较受试菌株间基因的差异。一般而言,RAPD分析适用于种下水平的分类学研究。RAPD具有用量少,鉴定迅速,具有可重复性等优点。

应用分子生物学方法,从遗传进化角度阐明真菌种群之间和种间内在分类学关系是目前真菌分类学研究的热点,从过去依赖形态和生理生化等表型特征描述逐渐引入分子生物学鉴定方法,按其亲缘关系和客观的反映系统发展的规律对真菌进行自然分类,达到人们追求已久的自然分类的目的,无疑是分类学发展过程中的重要转折。

HowtoDiscernFungiinMoleculeBiology

YUShu-ling

(XingtaiUniversity,Xingtai,Hebei,054001,China)

Abstract:Thisarticleanalyzestheoriesandmethodsofdiscerningfungiinmoleculebiology,classificationanddiscerningoffungiDNAbasicgroup,DNAmoleculehybridization,lengthoffungimtDNA!srestrictedfragmentdis tributionandrandomexpandedmulti-patternDNA.

KeyWords:bacterialstrain;restrictedinscribedenzyme;poly-enzymechainreaction