基因测序之基因芯片
物理学报Acta Phys. Sin. Vol. 62, No. 14(2013)148701
一种基于SU8聚合物的基因测序芯片*
韩伟静1) 2)
魏清泉1) 2)
李运涛1) 2)
周晓光1) 2)
俞育德1) 2) †
1) (中国科学院半导体研究所, 集成光电子学国家重点实验室, 北京100083)
2) (中国科学院半导体研究所, 中国科学院北京基因组研究所, 生物信息获取与传感技术联合实验室, 北京100083)
(2013年3月14日收到; 2013年4月2日收到修改稿)
基因测序技术极大地推动了生物学和医学研究的发展. 结合了焦磷酸测序原理及阵列式微反应池芯片的高通量测序仪在从头测序和宏基因组测序方面有着不可替代的作用. 本文首次提出并研制了一种基于SU8聚合物的基因测序芯片. 选择了高传输效率、低耦合损耗的光纤面板作为基片, 通过改善SU8均匀性及释放应力, 在光纤面板上成功制备出百万数量级阵列式微反应池; 设计并制作侧壁镀膜装置, 实现了SU8阵列式微反应池侧壁选择性光学薄膜蒸镀, 有效地提高了微反应池的光学隔离度, 将相邻微反应池之间的光串扰率平均值从25%降低到了1%,满足了高通量焦磷酸测序对测序芯片独立并行传输弱光信号的要求. 基于SU8聚合物的基因测序芯片制备工艺简单、成本低廉, 具有良好的应用前景.
关键词:DNA 测序, SU8, 微反应池, 光纤面板PACS:87.85.fk, 81.16.Nd, 78.20. −e
DOI:10.7498/aps.62.148701
本工作原理是:将包被有扩增后DNA 文库的微球
1引言
基因是指携带有遗传信息的DNA 序列, 是遗传的物质基础. 基因序列的测定是破译遗传信息、探索生命奥秘的必经之路. 从早期Sanger 手工测序法至今, 测序技术经历了第1代荧光标记Sanger 法测序技术[1]和第2代循环阵列测序技术的发展历程[2, 3], 并逐步向第3代直接测序技术研究迈进[4, 5]. 第一代测序技术测序读长较长, 原始数据准确性高, 但其对电泳分离技术的依赖限制了测序速度及并行化程度的进一步提升. 相对于第1代测序技术而言, 第2代测序技术测序成本低、速度快、通量高, 已成为现行主流测序方法[6].
在现有的第2代测序仪中, 基于焦磷酸测序原理的高通量基因测序仪以其测序速度快、读长长等优势在从头测序(de novo sequencing) 和宏基因组测序(metagenomesequencing) 方面有着不可替代的作用. 该测序仪以焦磷酸测序原理为基础, 通过阵列式微反应池测序芯片完成测序过程, 其基
及酶磁珠填入测序芯片的阵列式微反应池, 使焦磷酸测序反应在每个微反应池中独立进行, 阵列式微反应池的数目决定了测序通量. 测序芯片背面与CCD 紧密贴合, 测序反应释放的光信号从微反应池底部并行传输至CCD, 并以图像形式输出. 将测序全过程产生的图像经分析后对准叠加, 就可得到待测DNA 文库的碱基序列.
在高通量焦磷酸测序过程中, 测序芯片的光学传输性能及其阵列式微反应池的光学隔离度决定了测序结果的准确性. 单个微反应池中每次焦磷酸测序反应约释放106个光子(可见光波段) [7], 光信号十分微弱, 传输过程中的耦合损失及传输损耗会导致光信号衰减, 进而造成CCD 采集的原始图像信噪比明显降低, 测序准确性下降, 因此测序芯片需具备较高的传输效率及耦合效率. 此外, 由于焦磷酸测序反应在阵列式微反应池中同步进行, 相邻微反应池之间光信号相互串扰会造成CCD 采集的原始图像失真, 进而造成序列误判, 因此测序芯片的阵列式微反应池应具有良好的光学隔离性能.
*中国科学院科研装备研制项目(批准号:YZ200823) 和中国博士后科学基金(批准号:2011M500371) 资助的课题. †通讯作者. E-mail:[email protected] 2013中国物理学会Chinese Physical Society ⃝
http://wulixb.iphy.ac.cn
目前, 基于焦磷酸测序原理的高通量基因测序仪主要有454测序仪[8]和BIGIS-4测序仪[9], 其使用的测序芯片均是由Roche 公司研制的PTP (picotiter plate) [8, 10]. 据我们所知目前全球仅有Roche 公司具备生产PTP 的能力, 其价格昂贵, 约为1000美元/片, 且不可重复使用. 此外PTP 制备工艺复杂并且受到相关专利技术的保护. 在此, 提出了一种应用于高通量焦磷酸测序的SU8聚合物基因测序芯片来替代PTP.
焦磷酸测序过程产生的微弱光信号需要低损耗、高通量、并行传输, 因此基因测序芯片的基片材料选择受到诸多限制. 光纤面板是由单一孔径光纤束熔拉成块后切片而成, 具有传输效率高、耦合损失小、在光学上具有零厚度等特点[11−14], 是基因测序芯片基片的最佳选择.
光纤面板表面制作阵列式微反应池主要有三种方式:一是在光纤面板表面生长无机薄膜材料, 并采用半导体微加工工艺制作出阵列式微反应池; 二是将制作有阵列式微反应池的薄膜材料与光纤面板键合; 三是采用厚胶光刻工艺在光纤面板表面制作聚合物阵列式微反应池. 厚胶光刻工艺简单易行且制作成本低, 成为制作阵列式微反应池的首选途径.
在诸多应用于厚胶光刻工艺的光刻胶中, SU8机械性能优良且具有较好的生物兼容性[15−17], 是制备阵列式微反应池的理想材料. SU8是一种负性、环氧型、近紫外光刻胶, 由IBM 公司率先进行研究并应用于厚胶光刻工艺, 现已在微阵列芯片、bioMEMS 、微流控芯片等方面得到了广泛的研究与应用成品率
[18−20].
2设计与实验
2.1SU8基因测序芯片设计
SU8基因测序芯片由光纤面板基片和SU8阵列式微反应池构成. 选择光纤面板基片是为了实现焦磷酸测序过程产生的微弱光信号低损耗、高通量并行传输. 同时, SU8阵列式微反应池结构设计也会影响测序通量及测序准确性. SU8阵列式微反应池的数目决定了测序通量, 在相同面积下, 蜂窝结构可使得微反应池的数目达到最大, 为高通量测序提供保障. 高通量焦磷酸测序采用测序芯片与CCD 直接贴合的光学检测方式, 微反应池直接与CCD 像素匹配, 单个微反应池横截面积越大与其匹配的像素数目越多, 其光学图像越真实可信. 在微反应池数目相同的前提下, 六边形微反应池与其他几何形状(如菱形、矩形等) 相比横截面积最大, 与其匹配的像素数目也最多, 因此将SU8阵列式微反应池设计为六边形蜂窝结构.
如图1所示, 将SU8阵列式微反应池的尺寸设计为:对边距离28µm, 侧壁厚度6µm, 深度30µm. 对边距离由CCD 像素的物理尺寸决定, 其设计依据是每个微反应池匹配5个像素. 在CCD 可分辨的前提下, 侧壁厚度尽量缩小, 以增加阵列式微反应池密度. 阵列式微反应池的深度略大于包被DNA 文库的微球直径, 使每个微反应池中至多有一个包被DNA 文库的微球. 依此设计, SU8阵列式微反应池密度可达105个/cm 2.
但是SU8制作过程中厚度不均匀此外, SU8在可见光波段透射率较
性以及应力等问题极大地影响了其工艺重复性及
[21−24].
高[25, 26], 其制作的阵列式微反应池光学隔离度差, 相邻微反应池之间光信号串扰严重, 影响测序结果准确性.
本工作选择光纤面板为基片, 利用半导体微加工工艺制备了基于SU8聚合物的基因测序芯片. 通过优化厚胶光刻工艺, 克服了SU8制作过程中的均匀性差及应力等问题, 并在光纤面板上制备微米尺度的六边形蜂窝结构的阵列式微反应池. 研制了侧壁镀膜装置, 实现了在SU8基因测序芯片阵列式微反应池的侧壁选择性蒸镀反射膜, 提高了阵列式微反应池的光学隔离性能.
图1SU8阵列式微反应池结构示意图
2.2SU8基因测序芯片工艺制作
通过匀胶、前烘、曝光、后烘、显影等过程在光纤面板制作出SU8阵列式微反应池, 完成SU8基因测序芯片制作. 匀胶过程分为五个步骤:首先, 将光纤面板从静止加速到1200r/s并维持20s; 其
次, 将其加速到2000r/s并维持10s; 再次, 以将其加速到2100r/s并维持80s; 然后, 将其降速到1000r/s并维持10s; 最后逐步降速, 终止匀胶过程, 获得厚度为30µm 的SU8薄膜. 将表面旋涂有SU8薄膜的光纤面板放置在热板上前烘65◦C 5min, 95◦C 15min 后, 采用365nm 紫外光曝光, 曝光剂量为170mJ/cm2. 再次将其置于热板上后烘65◦C 1min, 90◦C 10min. 最后将光纤面板从热板上取下并放置于氮气柜中至室温, 取出显影3min 后形成SU8阵列式微反应池.
此外, 通过在210◦C 烘箱坚膜2h [27, 28]增加SU8阵列式微反应池机械强度及其与光纤面板的黏附性, 并采用梯度升温降温的方式来避免热应力的产生.
用Cy3荧光素标记的微球对镀膜前后的SU8基因测序芯片的光传输和光隔离性能进行检测.
2.3SU8基因测序芯片选择性镀膜
高通量焦磷酸测序多采用透射式光学检测, 因此要求SU8基因测序芯片阵列式微反应池底部透光同时侧壁不透光. 鉴于SU8在可见光波段具有较高透射率[24, 25], 需要选择性地在SU8阵列式微反应池侧壁镀膜. 常规的镀膜设备会在SU8阵列式微反应池侧壁及底部蒸镀相同厚度的薄膜, 为了达到选择性镀膜的效果, 在此对现有镀膜设备(InnotecC26VE25A) 进行了改造.
自行设计并制作的侧壁镀膜装置如图2所示, 其主要由支撑组件、连接臂、旋转定位装置、芯片安装座等组件构成. 旋转定位装置和芯片安装座通过连接臂与支撑组件连接, 并安装到镀膜设备的转动支架上. 其中, 连接臂与支撑组件形成夹角θ, 角度大小由SU8阵列式微反应池的深宽比决定. 在镀膜过程中操控旋转定位装置, 使其以连接臂为轴自转, 进而带动芯片安装座及芯片转动, 选择性地在SU8阵列式微反应池侧壁蒸镀厚度为50nm 的铝反射膜.
SU8基因测序芯片制作主要存在两个难点:一是SU8薄膜均匀性差造成的光学衍射限制了光刻分辨率, 导致SU8阵列式微反应池尺寸与设计尺寸有偏差; 二是制备过程中产生的应力易造成SU8阵列式微反应池形变甚至从光纤面板上整体脱落.
SU8薄膜均匀性主要由匀胶过程决定. 由文献报道可知[20−23], SU8匀胶通常采用普通匀胶方法:首先, 通过预匀将SU8涂布于基片表面; 其次, 通过改变匀胶转速与加速度, 来调节SU8薄膜厚度; 最后终止匀胶过程, 得到所需厚度的胶膜. 如图3所示, 普通匀胶后SU8薄膜的胶边厚度最高达
图2侧壁镀膜装置(a)装置结构示意图; (b)装置实物图
3结果与讨论
3.1制作工艺对SU8基因测序芯片的影响
2.4表征
SU8薄膜的厚度及均匀性通过台阶仪(TencorKLA-Tencor P-6) 进行表征. 侧壁镀膜的SU8阵列式微反应池端面及整体图用扫描电子显微镜(FEINove NanoSEM650) 观测. 用分光光度计(VarianCray 5E) 测试镀膜前后SU8薄膜的透射率. 最后使
到40µm, 高出中心区域10µm, 并且匀胶终止过程的加速度对SU8薄膜产生较大扭力, 造成的中心旋涡使SU8薄膜表面平整度变差. SU8薄膜厚度过高的胶边及表面不平整性导致其在接触式曝光过程中与掩膜版之间存在间隙, 进而造成光学衍射, 影响SU8阵列式微反应池图形质量.
了两个步骤:一是在预匀后, 将基片以5000r/s的加速度提速至2000r/s并维持10s. 此步骤旨在实现SU8薄膜初步平滑, 并利用高加速度将基片边缘多余的SU8甩出, 平滑胶边; 二是在快速匀胶后, 将基片以500r/s的加速度降速至1000r/s并维持10s. 此步骤实现了基片梯度降速, 避免了快速终止对SU8薄膜表面平整度的影响. 如图3所示, 采用五步匀胶方法之后, SU8薄膜的胶边厚度与中心区域差值在2µm 以内, 并且在整个基片范围内厚度均匀.
SU8制备过程产生的应力包括热应力和内应力, 热应力产生于SU8的前烘、后烘等加热过程, 内应力由SU8分子交联聚合过程产生. 如图4(a)所示, 未释放应力的SU8阵列式微反应池结构膨胀形变趋于圆形, 微反应池对边距为25.7µm, 侧壁厚度8.1µm, 与设计尺寸(对边距离28µm, 侧壁厚度6µm) 有较大偏差. 通过优化前烘、后烘过程的温
图3SU8薄膜厚度测试曲线
度与时间以及采用梯度升降温的方式来释放热应力, 同时, 在曝光后、显影前均将其放置在氮气柜中15min 以释放内应力. 如图4(b)所示, 释放应力后, SU8阵列式微反应池图形质量显著提高, 微反应池对边距为27.8µm, 侧壁厚度6.1µm, 与设计尺寸基本一致.
3.2SU8基因测序芯片侧壁镀膜及测试结
果
在SU8基因测序芯片设计中将其阵列式微反应池侧壁厚度设定为6µm, 而据文献报道SU8在可见光波段的透射率较高
[25, 26],
此侧壁厚度可能
无法有效隔离微反应池中的光信号. 在此将6µm 厚的SU8薄膜制备在石英衬底上并对其透射率进行精确测定, 结果如图5所示. SU8在可见光波段的透射率高于80%,由此说明6µm 厚的SU8侧壁无法有效隔离相邻微反应池之间的光学串扰, 需要对SU8阵列式微反应池侧壁进行光学隔离, 以降低其在可见光波段的透射率.
由光子能量传递关系A (吸收率%)+R (反射率%)+T (透射率%)=100%可知, 在吸收
图4SU8阵列式微反应池光学显微图片(a)释放应力前; (b)释放应力后
率一定的条件下, 可通过增加表面的反射率来减少透射率. 为了减少SU8阵列式微反应池侧壁的透射率, 可在侧壁蒸镀反射膜. 常用的反射膜有金属反射膜和全电介质反射膜两类. 全电介质反射膜通常
在此采用五步匀胶的方法改进SU8薄膜均匀性. 五步匀胶方法是在普通匀胶的基础之上添加
在特定波长有极高反射率且吸收率较低, 但很难在整个可见光范围内保持较高反射率. 而金属反射膜的工作波长范围宽, 且制备工艺简单, 其中铝反射膜在可见光波段反射率高且耐腐蚀, 与衬底材料黏附性好, 因此, 选择在SU8阵列式微反应池侧壁上蒸镀铝反射膜[29].
理论上, 铝反射膜的蒸镀厚度应大于其在可见光波段的穿透深度δ, 穿透深度δ的计算公式如下:
√√2λ
δ==, (1)
ωµσπc µσ其中, λ是波长, c 是真空状态下的光速, µ是磁导
率
, σ是电导率. 在可见光波段, 波长λ越大, 穿透深度δ越大. 为了保证铝反射膜在可见光波段有较高的反射率, 将λ设定为750nm, 代入(1)式得出穿透深度δ为4.5nm. 虽然理论上可见光在铝反射膜中的穿透深度较小, 但是为了保证铝反射膜在SU8表面的成膜质量及其厚度的均一性, 将铝反射膜厚度选择为50nm. 实验结果表明, 表面蒸镀50nm 铝反射膜的SU8薄膜在可见光波段透射率降至1.2%以下, 如图5所示.
其SEM 图如图6(b)所示.
现阶段SU8阵列式微反应池侧壁镀膜的厚度难以直接测定, 此处采用间接法对其厚度进行估测. 在相同的蒸镀条件下, SU8阵列式微反应池正对金属源方向的侧壁蒸镀厚度与平面蒸镀厚度一致, 因此可通过测量平面蒸镀的铝反射膜厚度来推导出侧壁蒸镀的铝反射膜厚度.
图5SU8薄膜镀膜前后透射率曲线
图6SU8阵列式微反应池侧壁镀膜SEM 图(a)剖面图;
(b)整体图
为了验证侧壁镀膜装置的选择性镀膜效果, 在蒸镀铝反射膜的过程中固定旋转定位装置, 以实现SU8阵列式微反应池正对金属源方向的部分侧壁镀膜. 将镀膜后的SU8阵列式微反应池放入砂轮划片机中划片, 并用扫描电子显微镜(SEM)观察其剖面. 如图6(a)所示, 正对金属源方向的部分侧壁与底部及其余侧壁颜色差异明显, 说明旋转定位装置固定后, 铝反射膜仅选择性地蒸镀在SU8阵列式微反应池正对金属源方向的部分侧壁上, 证明了侧壁镀膜装置的实用性. 匀速转动旋转定位装置, 在SU8阵列式微反应池各个侧壁均匀蒸镀铝反射膜,
3.3SU8基因测序芯片光学性能测试结果
与讨论
SU8基因测序芯片光学性能采用Cy3荧光素包被的聚苯乙烯微球进行测试. 通过离心作用将聚苯乙烯微球填充到SU8阵列式微反应池中, 正面观测Cy3荧光信号后翻转SU8测序芯片, 再从其背面观测Cy3荧光信号. 未镀膜SU8基因测序芯片背面的荧光显微图片如图7(a)所示, 与其正面观测的荧光效果高度一致(在此仅给出背面荧光显微图片), 由此可说明, SU8测序芯片可实现光信号的低
损耗、零厚度、并行传输. 此外, 镀膜后的SU8基因测序芯片背面的荧光显微图片如图7(d)所示, 与其正面观测的荧光效果高度一致(在此仅给出背面荧光显微图片), 进一步说明了侧壁镀膜装置可选择性地将铝反射膜蒸镀在SU8阵列式微反应池侧壁而非底部, 在提高微反应池光学隔离性能的同时保证了SU8基因测序芯片的光学传输性能.
未镀膜的SU8基因测序芯片相邻微反应池之间的光信号相互串扰, 降低了光学图像的信噪比. 在此将串扰光信号强度与总光信号强度的比值定
义为光串扰率, 并统计了200个独立发光微反应池的光串扰率. 由图7(b),(c)可知, 未镀膜的SU8基因测序芯片相邻微反应池之间光学串扰严重、光学隔离效果差, 光串扰率主要分布在20%—30%之间, 峰值为25%,无法满足BIGIS-4测序仪的需求. 如图7(e),(f)所示, 镀膜后的SU8基因测序芯片微反应池可有效地限制其内部的光信号向相邻微反应池传输, 光串扰率主要分布在2%以下. 镀膜的SU8测序芯片满足BIGIS-4测序仪对光信号高通量、独立并行传输的要求, 可用于后续的测序实验.
图7SU8基因测序芯片荧光显微图片(a)镀膜前; (d)镀膜后; (b),(e)分别为两者微反应池三维光强分布; (c),(f)分别为两者光串扰率直方图
4结论
在光纤面板上采用厚胶光刻工艺制备了一种应用于高通量焦磷酸测序的SU8聚合物基因测序芯片. 通过优化匀胶过程改善SU8的均匀性, 并有效地释放其制作工艺中产生的热应力和内应力, 在光纤面板上制作出百万个尺寸均一的阵列式微反应池, 其密度达到105个/cm 2. 利用侧壁镀膜装置
实现了SU8阵列式微反应池侧壁选择性镀膜, 在提高微反应池光学隔离性能的同时保证了SU8基因测序芯片的光学传输性能. 镀膜后SU8基因测序芯片的光学串扰率平均值降至1%,实现了弱光信号的低损耗、高通量、无畸变、零光学厚度的并行传输, 满足高通量焦磷酸测序仪对测序芯片光学性质的要求. SU8基因测序芯片应用实验在进行中.
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Fabrication of SU8-based chip suitable for genomic
sequencing ∗
Han Wei-Jing 1) 2)
Wei Qing-Quan 1) 2)
Li Yun-Tao 1) 2)
Zhou Xiao-Guang 1) 2)
Yu Yu-De 1) 2) †
1) (State Key Laboratory of Integrated Optoelectronics, Institute of Semicnductorss, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100083, China )
2) (The Joint Laboratory of Bioinformation Acquisition and Sensing Technology, Institute of Semicnductorss, Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of
Sciences, Beijing 100083, China )
(Received 14March 2013; revised manuscript received 2April 2013)
Abstract
DNA sequencing technology has markedly advanced the development of biological and medicinal sciences. High-throughput pyrosequencing instruments that combine the pyrosequencing with microfabricated high-density picoliter reactors have been proved to be suitable for de novo sequencing and metagenome sequencing. In the present work, we report on an alternative sequencing chip consisting of hundreds of thousands of picoliter sized honeycombed SU8reaction vessels on a fiber-opticslide by lithography technique for high-throughput pyrosequencing instruments. Highly reproducible fabrication process of SU8sequencing chip is achieved through the improvement on SU8filmthickness uniformity and relaxation of SU8residual stress during fabrication. To achieve the optical isolation required for SU8reaction wells, metal filmis selectively deposited on the side walls of the reaction vessels by reformating vacuum coating. With the metal coating, the average value of optical cross talking between SU8reaction vessels is reduced from 25%to 1%.The SU8sequencing chip demonstrates an excellent light transmission characteristic and meets the need of pyrosequencing application.
Keywords:DNA sequencing, SU8, picoliter well, fiberoptic plates PACS:87.85.fk, 81.16.Nd, 78.20. −e
DOI:10.7498/aps.62.148701
*Project supported by the ScientificEquipment Research Project of China Academy of Science (GrantNo. YZ200823) and the China Postdoctoral Science Foundation (GrantNo. 2011M500371). †Corresponding author. E-mail:[email protected]