遗传学实验

实验一 细胞减数分裂观察

实验原理减数分裂是有性繁殖生物形成配子时的一种特殊的细胞分裂方式，减数分裂和受精作用成为多细胞生物世代间传递的中间环节，这种分裂方式保证了生物在世代传递过程中体细胞染色体数目的恒定不变，即都含有两个基本染色体组（二倍体生物），又可以实现物种内个体间遗传上的多样性。

减数分裂包括两次细胞分裂阶段，第一次是细胞染色体数目减半的分裂，第二次分裂是细胞染色体数目等数的分裂。

３．试剂：卡诺氏固定液（乙醇 : 冰乙酸 = 3 : 1）；醋酸洋红染色液（45%乙酸100mL+洋红1g 加热煮沸不超过30秒，冷却，加一枚生锈的铁钉，静置片刻过滤）。 1. 玉米花药压片（2n = 20） ⑴ 取材：玉米抽穗前的大喇叭口期，取出花序分枝备用； ⑵ 固定：雄花序在卡诺氏固定液中固定12～24小时后，可用于制片。 ⑶ 染色和压片；取一枚花蕾，去除颖片，取出花药，置于干净的载玻片上，吸去多余的固定液，滴加一滴醋酸洋红染色液，用解剖针将花药切断成碎段并压出花粉母细胞。静置15～20分钟。加盖玻片，再在上面覆盖吸水纸，用大拇指压片（切勿使盖玻片滑动），也可以用解剖针柄轻敲盖玻片以使细胞和染色体分开。 ⑷ 镜检：低倍镜下寻找花粉母细胞，再用高倍镜观察减数分裂各个时期染色体的形态和运动特征。 蝗虫精巢压片（2n = 24）⑴ 取材并固定：从野外捕获的雄性蝗虫经卡诺氏固定液固定，即可用于制作减数分裂标本片。 ⑵ 剖解精巢：实验前将蝗虫置于培养皿中，剖取蝗虫的精巢。剔除精巢周围的其他组织后，就可以进行染色处理。 ⑶ 染色和压片；挑取一小段精巢置于干净的载玻片上，滴加一滴醋酸洋红染色液，用解剖针反复将精巢切断成碎段（尽可能碎），挑出肉眼可见的组织碎块，静置15～20分钟。再加盖玻片并在上面覆盖吸水纸，用大拇指压片（切勿使盖玻片滑动），也可以用铅笔头等轻敲盖玻片以使细胞和染色体分开。 ⑷ 镜检：低倍镜下寻找具有清晰分裂相的细胞，再用高倍镜观察减数分裂各个时期染色体的形态和运动特征。 由于减数分裂是一个连续的过程，在一张标本玻片上可能不能同时观察到各个分裂时期染色体的形态特征，因此尽可能多地寻找细胞分裂相

实验二 果蝇唾腺染色体的观察 观察果蝇的唾腺染色体、特征：①巨大，② 染色体上横纹的染色性能、横纹数目及排列方式，③ 各染色体的异染色质多的着丝粒部分相互靠拢形成染色中心。

实验原理果蝇、摇蚊等双翅目昆虫幼虫期的唾腺细胞很大，其中的染色体——唾腺染色体，是由500 - 1000条染色线聚在一起形成的，故又称多线染色体（长约400μm ，宽约5μm ，比普通染色体大千倍），是进行染色体畸变观察和研究的好材料。

唾腺染色体只有5条染色体臂，即2L、2R、3L、3R、X（端部着丝点染色体），有时也可在染色中心处发现短小的（点状）第IV 号染色体，而Y染色体几乎包含在染色中心里。 二）、实验步骤

１．幼虫培养：营养条件好，温度低则幼虫个体肥大，便于操作。当幼虫爬上培养瓶壁准备蛹化前，即为三龄幼虫。

２．唾腺剖取： 选取一只发育良好，个体肥大的三龄幼虫置于载玻片上的蒸馏水中，双手各持解剖针，左手用解剖针压住虫体中后部（末端1/3处），固定幼虫，右手用解剖针按住幼虫头部（口器稍后方），轻轻向前拉，使头部扯离虫体，唾腺会被随之拉出来，这时可看到一对透明的囊状腺体，其一侧附着着一条泡沫状脂肪体，这就是果蝇的唾液腺。用解剖针剔除脂肪体，只保留唾腺。 3．解离唾腺： 用吸水纸吸去蒸馏水（用解剖针挡住唾腺，勿使唾腺被吸附到吸水纸上），在唾腺上滴一滴1mol/L 盐酸，浸泡2 - 3分钟，使组织疏松，以便压片时细胞分散，染色体展开。吸去盐酸（仍然用解剖针挡住唾腺），水洗吸干。

4．染色和压片： 唾腺上滴加1%的醋酸洋红染色液，静置染色15 - 20分钟。加盖盖玻片，覆以吸水纸，用拇指适当用力压片（必要时轻敲盖玻片，以使染色体展开）。 ５．镜下观察： 压好的片子即可置于显微镜（低倍）下观察，找到分散好的唾腺染色体后，换用高倍镜观察，对照教材上的图片，寻找染色中心和辨认各条染色体臂（2L、2R、3L、3R、X、IV）。

多线染色体的形成原因，染色体上的横纹与基因座位的排列有何对应关系。

果蝇的唾腺位于幼虫前端的食道两侧和神经球附近。其中的唾腺染色体是由于唾腺细胞只长大但不分裂，染色体多次复制但不分裂，同源染色体紧密并合在一起，且染色体的螺旋相当松开，因而形成多线特征的巨大染色体。

对应关系：横纹数目和位置往往是恒定的，代表果蝇等昆虫的种的特征；如染色体有缺失、重复、倒位、易位等，很容易在唾腺染色体识别出。横纹有深浅、疏密的不同各自对应排列，这意味着基因的排列。

实验三植物染色体畸变观察 一）、植物多倍体人工诱发原理生物的染色体数目一般是相当稳定的，这是物种遗传稳定性的重要特征之一。遗传学上把二倍体生物的一个配子的染色体数，称为染色体组。具有两个完整染色体组的生物体或细胞称为二倍体，自然存在的生物多属于二倍体，核内多于两个染色体组的生物体则称为多倍体。其中增加的染色体组来自同一物种或者是源于染色体组加倍，称为同源多倍体。

秋水仙素、对二氯苯等都可用于诱发多倍体，其中以秋水仙素效果最好，使用最为广泛。其主要作用原理是抑制细胞分裂时纺锤体的形成，使染色体不能移向两极而被阻止在分裂中期，这样细胞不能继续分裂，从而产生染色体数目加倍的核。

孚尔根(Feulgen)核染色法原理细胞内的DNA在1mol/L HCl 60℃水解时部分地破坏了脱氧核糖与嘌呤碱基之间的糖苷键而使嘌呤碱基脱掉，从而使脱氧核糖的第一个碳原子上潜在的醛基暴露。

无色的亚硫酸品红（Schiff试剂）是由偏重亚硫酸钠、盐酸和碱性品红配制成的。偏重亚硫酸钠与盐酸能产生亚硫酸根，当具有醌式结构的碱性品红分子与亚硫酸根结合后，醌式结构的共轭双键被打开，碱性品红变为无色。当用这种无色的亚硫酸品红去染色经酸解的细胞时，就会与染色体DNA上游离的醛基结合，又出现了醌式结构，从而使DNA着色，使染色体呈现出红色。

孚尔根染色法的优点是制片清洁，染色体清晰，组织软化好，易于压片。其缺点是，染色体较软，容易缠绕，不易分散，在加强前处理使染色体缩短的情况下，可获得较好的效果。

细胞微核测试原理微核(micronuclei, MCN) 是真核类生物细胞中的一种异常结构，往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生的不可逆遗传损伤。

一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的断片产生的，整条染色体或几条染色体也能形成微核。这些断片或染色体在细胞分裂末期被两个子细胞核所排斥便形成第三个核块。即在间期细胞形成时，核附近出现的一到几个很小的圆形结构，直径大约是主核1/3以下呈圆形、椭圆形或不规则形，这就是微核（micronucleus）

微核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面,是一种比较理想的方法。

内容之一 植物多倍体人工诱发及鉴定

1．根尖培养将洋葱或大蒜刮去老根，室内水培养至新根长出0.5～1.0cm左右。

2．多倍体诱导：当洋葱或大蒜新根长至0.5～1.0cm左右时，用含0.01～0.05%秋水仙素的水溶液，置阴暗处培养4h～2d，及时观察，至根尖膨大为止，再恢复生长（学生查阅资料，自主设计秋水仙素浓度梯度和时间梯度处理洋葱根尖）。 3．固定恢复生长的根尖用蒸馏水冲洗并用卡诺氏固定液(无水乙醇:冰醋酸=3:1) 固定2～24h备用。

4．解离:固定好的根尖，加入适量预热的1 mol/L盐酸，60 C水浴8-10分钟。同时以室温下的盐酸解离根尖作对照。

5．染色:将解离过的材料水洗3次，吸净水分，加入希夫试剂，盖好磨口试管塞，染色10分钟（在黑暗条件下处理）。

以室温下酸解和1%醋酸洋红染色作对照。

6． 漂洗:希夫试剂染色后，先用蒸馏水冲洗，再用漂洗液密封漂洗3次，每次2～5分钟，再水洗2～3次。 7． 压片:取根尖置于载玻片上，取分生区组织长约0.5mm，压碎，加盖玻片，覆以吸水纸压片；必要时敲击盖玻片以利分散。 8．观察

低倍镜下寻找染色体分散良好的分裂相，换高倍镜观察并计数染色体数目，鉴别染色体加倍的细胞和未加倍的细胞。

微核千分率：MCN‰=（观察到的微核细胞数/观察的细胞总数）×1000‰

染色体畸变率：CAF﹪=（染色体畸变细胞数/分裂期的染色体细胞数）×100﹪

在大蒜/洋葱根尖细胞微核检测中为什么要恢复培养？ 大蒜根尖细胞经诱变剂处理后，发生DNA损伤，但如果细胞不分裂的话，还是保持原来的单细胞核状态，也就是说并不形成微核。只有经恢复培养后，经有丝分裂，DNA损伤得以表现出来，而这种表现就是微核的形成。所以说要观察到微核，必须经过恢复培养。 实验四 果蝇形态、生活史及果蝇培养观察

实验原理果蝇是完全变态（生活史包括卵、幼虫、蛹和成虫四个阶段）的双翅目昆虫。具有生活史短（25 ℃，大约9～11天完成一个世代），突变型多且多为形态突变，染色体数目少（2n = 8），而且有巨大的唾腺染色体，繁殖率高（每个雌果蝇可产卵400 - 500个），饲养简便等特点

原种的培养：选没有混杂的原种果蝇5 - 10对作为亲本，移入装有培养基的培养瓶中，贴好标签10 - 15 ℃恒温培养箱中培养，每2 - 4周更换一次培养基。

果蝇生活史观察：果蝇生活史与温度密切相关，最适宜温度为25 ℃，30℃以上高温会造成不育或死亡。

果蝇的外形：果蝇体分头、胸、腹三个部分，头部有一对大的复眼，三个单眼和一对触角，胸部有三对足，一对翅，在后足和翅之间有一对平衡棒，腹背面有黑色环纹，腹面有腹片，外生殖器在腹部末端。

实验五 果蝇饲养和杂交综合实验

收集处女蝇并进行杂交组合杂交实验前需要收集纯合体处女蝇与纯合雄性果蝇。将亲本成蝇移出培养瓶后，再过8～12小时内所收集到的新羽化的雌性果蝇，即为处女蝇。对新羽化的果蝇作雌雄鉴定，然后分别饲养。为杂交试验做准备。

控制黑檀体（e）突变型的基因位于第三号染色体上，控制白色复眼（w）、的基因位于X染色体上。故可利用E/e这对常染色体上的等位基因作单因子杂交组合，利用E/e 和X+/Xw两对等位基因作双因子杂交组合，用位于X染色体上一对等位基因 X+/Xw 作伴性遗传验证实验。 可选取白色复眼果蝇与黑檀体果蝇作杂交组合，正反交各一，贴好标签（世代、杂交组合、日期、姓名），置于25℃恒温培养箱中培养。

实验八 质粒DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测

质粒性质质粒是染色体外的DNA分子，大小在1kb到200kb。大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在，它是细菌内的共生型遗传因子。 质粒按复制方式分为两种类型：松弛型质粒 20～200个拷贝 /细胞;严紧型质粒 1～2个拷贝 /细胞

实验原理 碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0 ~12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。 当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

质粒3种构型1.超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalelltly closed circular DNA，简称cccDNA);2.开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA的一条链断裂，(open circular DNA，简称ocDNA);3.线形质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 两条链发生断裂(linear DNA，简称LDNA)。

琼脂糖凝胶电泳检测DNA

实验原理DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖—磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。

凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。如上次实验提取的质粒DNA，有3种构型,这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。

胶板的制备 1．取干净的有机玻璃内槽，用透明胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好(一定封严，不能留缝隙)。 2．将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。 3．将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，加入EB后，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(不要形成气泡)。注意：溴化乙锭为致癌物，须戴一次性塑料薄膜手套操作，并小心污染环境。

4．待胶凝固后，取出梳子，撕下透明胶带，放在电泳槽内。

5．加入电泳缓冲液至电泳槽中。 电泳1．接通电泳槽与电泳仪的电源(注意正负极， DNA片段从负极向正极移动)。DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。 2．当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1~2cm处，停止电泳。

实验九大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 实验原理 细菌处于0℃，0.1M CaCl2低渗溶液中，使菌细胞膨胀成球形，处于容易吸收外源DNA的状态，该状态称为感受态。感受态的本质与存在可能局部原生质体化假说－－感受态细胞的表面形成一种能接受ＤＮＡ的酶位点， 使ＤＮＡ分子能进入细胞 DH5α 菌株

一种常用于质粒克隆的菌株。其 j80lacZ△M15基因的产物可与pUC载体编码的b-半乳糖苷酶氨基端实现α互补，可用于蓝白斑筛选。recA1 和endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。 转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。

转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基—钙磷酸复

合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Ampr等)得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上。

ＤＮＡ分子转化分以下几步: ①．吸附——双链DNA分子吸附于受体菌表面；②．转入——双链DNA分子解链。一条链进入受体菌，另一条降解；③．自稳——外源质粒DNA分子在细胞内复制成双链；④．表达——供体基因随同复制子同时复制，分裂,转录翻译。 １．计算转化率

转化率＝转化子总数/感受态细胞总数

转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化原液总体积/涂板体积

感受态细胞参考数为2×106~2×107

实验十、 PCR基因扩增及PAGE电泳检测

实验原理 1. 多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)的原理类似于DNA的天然复制过程。以人工合成的与待扩增DNA片段的两翼相互补的两个寡核苷酸短序列为引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，可

将目的DNA扩增上百万倍。

2.聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。 在混合样品中各组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷多少。 (四)样品处理及加样

一般加样体积为10－15uL如样品较稀，用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。 (五) 电泳

将直流稳压电泳仪开关打开，将电压调至1—8V/cm。当溴酚兰染料迁移至底部时，将电流调回到零，关闭电源。拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中。