小鼠胰岛微血管内皮细胞外泌体的提取和鉴定方法_肖芳
第53卷Vol．53第1期No．1山东大学学报（医学版）
JOUＲNALOF SHANDONG UNIVEＲSITY（HEALTH SCIENCES ）
DOI ：10．6040/j．issn．1671-7554．0．2014．348
2015年1月Jan．2015
·基础医学·
文章编号：1671－7554（2015）01－0006－04
小鼠胰岛微血管内皮细胞外泌体的
提取和鉴定方法
肖芳
1，2，3
11112，4
，蒋卫东，王晓红，秦爱琼，韩敏，陈丽
（1．山东大学第二医院干部保健科，山东济南250033；2．山东大学内分泌代谢病研究所，山东济南250033；3．山东大学细胞治疗研究中心，山东济南250033；4．山东大学齐鲁医院内分泌科，山东济南250012）
建立小鼠胰岛微血管内皮细胞来源的外泌体的提取和鉴定方法，为糖尿病胰岛微血管内皮受损的发
1）细胞病机制研究及重建胰岛微循环完整性的应用提供必要材料。方法选取小鼠胰岛微血管内皮细胞株（MS-作为研究对象，取其培养上清液，经多步离心结合蔗糖/D2O垫超速离心方法获取提取物，然后采用透射电镜和
Western blotting 法对提取物进行形态和蛋白成分分析，以确定其是否为外泌体。结果提取物呈形态均一的类圆形囊泡，有完整双层膜包绕，内部含有低电子密度物质。囊泡大小约为40 100nm ，可散在分布，也可聚集成团，
CD9和TSG101分子。结论经过形态和蛋白成分分析证实所提取到的物质正是MS-1提取物均阳性表达CD63、
细胞来源的外泌体，便于后续临床和基础研究工作的开展。
关键词：小鼠胰岛内皮细胞；外泌体；离心；提取中图分类号：Ｒ587．1
文献标志码：A
摘要：目的
Extraction and identification of mouse islet microvascular
endothelial cells （MS-1）-derived exosomes
2，34
XIAO Fang 1，，JIANG Weidong 1，WANG Xiaohong 1，QIN Aiqiong 1，HAN Min 1，CHEN Li 2，
（1．Department of Cadre Health Care ，Second Hospital of Shandong University ，Jinan 250033，Shandong ，China ；
2．Institute of Endocrinology and Metabolism ，Shandong University ，Jinan 250033，Shandong ，China ；
3．ＲesearchCentre for Cell Therapy ，Shandong University ，Jinan 250033，Shandong ，China ；4．Department of Endocrinology ，Qilu Hospital of Shandong University ，Jinan 250012，Shandong ，China ）Abstract ：Objective
To establish a method for mouse islet microvascular endothelial cells （MS-1）-derived exosome
Exosomes from the supernatant of MS-1cells were collected by the combina-The extract was of round vesicle structure ，surrounded by an intact double
extraction and identification．Methods （TEM ）and Western blotting．Ｒesults
tion of step-by-step centrifugations and ultracentrifugation ，then characterized by transmission electron microscopy membrane ，containing low electron density material inside．The diameters of exosomes ranged from 40-100nm．The exosomes scattered or gathered into a micelles ，and positively expressed CD63，CD9，and TSG101molecules．Conclusion
The extracts are proved to be exosomes and the method for extraction and identification will facilitate fur-ther clinical and basic researches．
Key words ：Mouse islet endothelial cells ；Exosome ；Centrifugation ；Isolation
外泌体是由多种细胞类型均可以分泌到细胞外
［1］
基质中的一种直径约30 100nm 的膜性囊泡，是在网织红细胞分化过程中发现并被认为是红细胞排
［2］
外泌体不除废弃蛋白的一种方式。有研究发现，
05-28；网络出版时间：2014-10-2210ʒ 26收稿日期：2014-网络出版地址：http ：//www．cnki．net /kcms/doi/10．6040/j．issn．16717554．0．2014．348．html
基金项目：山东省科技攻关国际科技合作项目（2010GHZ20201）；济南市科技局科技明星项目（20100318）mail ：chenli3@medmail．com．cn 通讯作者：陈丽。E-
肖芳，等．小鼠胰岛微血管内皮细胞外泌体的提取和鉴定方法
7
DC 淋巴细胞、仅存在于造血细胞如红细胞、血小板、［3］
同时也存在于血浆、血细胞等的培养上清液中，
［4］
清、乳汁、唾液及尿液等许多生物体液中。外泌体的产生和分泌机制十分复杂并受到多种调节因子的调控。当细胞经由胞吞作用形成早期核内体后，在演变为晚期核内体的过程中不断以向内部出芽的方式积累大量囊泡，同时选择性摄入胞浆蛋白（包CD63、TSG101等为普遍存在的特异性蛋括CD9、［1］
脂质成分及ＲNA（包括mＲNA和microＲ-白）、
NA ），继而生成多泡体（multivesicular bodies ，MVBs ）［4］。基于它们的生物学特性，细胞内的MVBs 可能被输送到溶酶体中降解其内含物，或者与细胞膜融合使内容物整合于细胞膜表面，再者与细胞膜融合后释放其内部的囊泡，即所谓的“外泌
［5］
体”。外泌体被其来源细胞分泌到细胞外基质后，通过生物体液的运输到达靶细胞并被靶细胞摄
600）。1．2
方法
1．2．1MS-1细胞培养选取第4 5代MS-1细
胞，复苏后重悬于添加双抗的含5%FBS 的低糖DMEM 培养液（100mL 低糖DMEM 培养液含5%
50U /mL青霉素和50ng /mL的链霉素）胎牛血清、
5%CO 2饱和湿度培养箱中培养。中，置于37ħ 、
24h 后更换新鲜培养基，继续培养并传至6 7代。
6为进行后续外泌体提取，大约4ˑ 10个细胞种植于直径150mm 培养皿内，每皿添加13mL 培养液培
养细胞生长至70%汇合，更换无血清低糖DMEM 培养基继续培养细胞24h 。1．2．2
外泌体提取收集上述培养上清液后离心，
4ħ ，300ˑ g ，低温离心15min ，去除细胞及大细胞碎1200ˑ g ，片；4ħ ，低温离心20min ，去除小细胞碎
10000ˑ g ，低温离心30min ，片；4ħ ，取上清液，小2．4g Tris 心移至含Tris /蔗糖/D20（30g 无酶蔗糖，
碱溶于50mL D20中，调至pH 7．4，过滤除菌备用）4ħ ，100000ˑ g ，离心2h ，超速离心管中，收集缓冲
4ħ ，100000ˑ g 离心2h ，垫；预冷PBS 混悬稀释后，
收集黄白色沉淀外泌体；PBS 重悬外泌体后，
0．22μm 滤膜过滤除菌，－80ħ 保存备用；待用时，BCA 法定量外泌体的总蛋白。
1．2．3外泌体鉴定①外泌体电镜负染：取20μL 外泌体悬液滴加于直径为2nm 载样铜网上，滤纸吸干液体后，室温静置5min ，于铜网上滴加3%磷钨酸溶液量约10μL ，负染5min ，在透射电镜拍照前
［8］
用白炽灯65ħ 烘烤约15min 。②采用SDS-PAGE 电泳法、Western blotting 法分析：外泌体悬液
取获得其内含成分后发挥生物学效应
［2］
。外泌体
扮演着细胞与细胞之间交流对话的媒介，并作为细胞间信息的传递体在多种病理生理条件下具有一定
作用，特别是其参与炎症、动脉粥样硬化、免疫调节过程等方面。
近年研究提示，胰岛微血管内皮细胞（islet mi-crovascular endothelial cells ，IMECs ）损伤在糖尿病发病机制中具有关键作用，特别是在2型糖尿病的发生发展过程中往往伴有不同程度的IMECs 破坏
［6-7］
。本实验通过分离、纯化和鉴定步骤验证了
小鼠胰岛微血管内皮细胞外泌体的存在，为糖尿病胰岛微血管内皮受损的发病机制研究及重建胰岛微循环完整性的应用提供必要材料。
1
1．1
材料与方法
材料细胞系
95ħ ，添加上样缓冲液，变性10min ，每个上样孔添
PAGE 电泳分离，加40μg 样品，经10%SDS-浓缩胶恒压80V ，分离胶恒压120V ，至溴酚蓝带泳至胶底
以上约1cm 处终止电泳，电转移至硝酸纤维素膜4ħ 结合摇床过夜，上，加入不同一抗，加入辣根过氧化物酶标记的相应二抗，室温孵育1h ；TBST 充10min /次。ECL 增强发光液显色分洗膜3次，后，于凝胶成像系统曝光，显影定影后观察结果。
［9］
MS-1细胞（小鼠胰岛微血管内皮
细胞系）购自美国模式培养物集存库。
1．1．2主要试剂与仪器含5%胎牛血清DMEM 低糖培养基购自美国Gibco 公司；抗小鼠CD63、TSG101分子单克隆抗体购自美国Santa Cruz 公司；Calnexin 分子单克隆抗体购自美国抗小鼠CD9、
Abcam 公司；超速离心管购自美国Beckman 公司；BCA 蛋白定量试剂盒购自博士德生物工程有限公司；ECL 发光试剂盒购自美国Pierce 公司；倒置相100XP 低差显微镜（日本Olympus 公司）；Optima L-温超高速离心机（美国Beckman 公司）；酶标仪（美
国ABI 公司）；低分辨率透射电镜（日本Hitachi H-
1．1．1
2
2．1
结果
MS-1细胞形态学观察体外培养MS-1细胞
生长速度快，细胞周期短。倒置相差显微镜下观察，
细胞接触融合前呈短梭形，贴壁生长；随着细胞数目增多，细胞间隙越来越窄，细胞形态趋于长梭状，细胞间连接融合紧密。见图1。
8
山东大学学报（医
［14］
学版）53卷1
期
殖2型糖尿病是由于外周组织胰岛；另一方面，
素抵抗和胰岛β细胞功能缺失导致相对胰岛素缺乏，而胰岛血管功能缺失也直接参与2型糖尿病胰岛功能衰竭的发生发展过程
［15］
。
1细胞培养上清本实验首次提取并纯化了MS-液中的外泌体，如纯化步骤不严谨，外泌体就会被许多其他结构如脱落小泡（shedding microvesicles ，SMVs ）和凋亡小泡（apoptotic blebs ，ABs ）所污染，
1细胞的形态学观察（ˑ 100）图1MS-Fig．1The morphologic observation of MS-1cells （ˑ 100）
SMV 是多种类型细胞膜脱落形成并需要钙蛋白酶、
翻转酶、拼接酶等的参与，ABs 是由凋亡细胞或正处于死亡阶段的细胞释放到细胞外基质中的膜泡，
［16］
是皱缩细胞的残余物。在细胞凋亡早期主要以SMVs 为主，而在凋亡晚期阶段ABs 成为主要产物。SMVs 直径约为100 1000nm ，ABs 直径约为100 500 nm ，形态差异很大，密度均大于1．16g /mL。外泌体与SMVs 和ABs 相比要小得多（40 100nm ），
［16］
并且形态均一，密度为1．13 1．19g /mL。值得因此需更注意的是，外泌体存在于生物血清中，换无血清培养液后再收集上清液；另外，整个提取过程均需在0 4ħ 环境中进行，否则影响提取效果，
7
1细胞可提取（200ʃ 40）μg 外大约2ˑ 10个MS-泌体（按BCA 蛋白定量法计量）。
本实验通过不同离心力离心、密度梯度离心等方法提纯了培养液中的外泌体，并通过透射电镜负染和蛋白质印迹法完成了对纯化后外泌体的鉴定。Calnexin 为普遍存在于细胞内质网膜上的蛋白质，在细胞全蛋白中高表达，而外泌体中不含有该种蛋白质，因此可以作为外泌体纯化达标的标志。
［4］
2．2
CD9、外泌体形态学观察及特异性蛋白CD63、
TSG101分子表达透射电镜负染观察，MS-1细胞来源的外泌体呈形态均一的类圆形囊泡，有完整双
层膜包绕，内部含有低电子密度物质。囊泡约40 100nm ，可散在分布，也可聚集成团，见图2A 。MS-1细胞来源的外泌体及其来源细胞全蛋白普遍CD9、TSG101存在于外泌体中特异性抗体CD63、分子的表达，见图2B
。
图2Exosomes 形态学观察（A ）及特异性蛋白表达（B ）
Fig．2The morphologic observation （A ）and specific protein
expression of exosomes （B ）
本实验结果显示，所获得的提取物大小、形态与
PAGE 特征性标志分子和文献外泌体相符，其SDS-，1因此确定所获得的提取物为MS-细胞外泌体，是一种比较可靠的提取方法，基本可以报道类似
满足实验研究的要求，为后续进行糖尿病胰岛微血管内皮受损的发病机制及重建胰岛微循环完整性的
实践提供了必要材料。
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［2，17］
3讨论
外泌体是一类新兴的细胞间信息传递的媒介，由活细胞分泌和释放，并携带了与其来源细胞不同
的蛋白、脂质和（或）ＲNA结构，在机体炎症、免疫调节、凝血、动脉粥样硬化等多种病理生理过程中都扮演着重要角色。不同细胞来源及不同病理生理条件下的外泌体往往具有抗原提呈持表皮祖细胞功能
［12］
［10］
［11］
、心肌重塑、维
等不同的理化性质。IMECs ，IMECs 可近年研究表明，
是构成胰岛微循环组织屏障的最主要成分，与胰岛内分泌功能关系密切
［13］
促进胰腺内分泌部发育，并上调胰岛发育相关基因
1及胰岛素基因表达，如PDX-促进胰岛细胞增
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（编辑：徐苗蓁）
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（编辑：顾黎）