细菌的革兰氏染色法
实验二 细菌的革兰氏染色法
一、实验目的
学习细菌的革兰氏染色原理和方法。
二、实验原理
单染色法:只能观察微生物的大小、形状、和细胞排列状况,但不能鉴别微生物以及它的特殊构造等。
复染色法:用两种或两种以上染色液进行染色,有协助鉴别微生物的作用,故也称鉴别染色法。常用的有:革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、鞭毛染色法等。
革兰氏染色机制:由于G-肽聚糖层较薄,交联度低,含较多脂质,故用乙醇等有机溶剂脱色时融解了类脂质,增加了细胞的通透性,使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出,经沙黄复染呈红色。而G+细胞壁结构致密,用脱色剂处理后,肽聚糖层孔径缩小,通透性降低,故细菌仍保留初染时的紫色。
三、实验材料
大肠杆菌、金黄色葡萄球菌(24h培养物)、革兰氏染色液一套
四、实验步骤
1. 涂片
2. 固定
3. 初染:在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液,染1分钟,倾去染液,流水冲洗至无紫色。
4. 媒染:先用新配的路哥氏碘液冲去残水,而后用其覆盖涂面1分钟,后水洗。
5. 脱色:除去残水后,滴加95%酒精进行脱色约15-20秒,后立即用流水冲洗。
6. 复染:滴加番红染色液,染3-5分钟,水洗后用吸水纸吸干。
7. 镜检:观察染色结果并绘图。
五、实验结果
记录所观察到的两种菌革兰氏染色颜色的差别,并绘图。
如图所示,被染为紫色的部分即为金黄色葡萄球菌,红色部分即为大肠杆菌。
六、问题与讨论
要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些操作?哪一步是关键?Why?
按照操作顺序来看
1、首先,必须强调的是实验过程中全程的无菌操作:玻片的消毒、接种环的杀菌以及实验所用材料试管的无菌使用;
2、其次,是金黄色葡萄球菌以及大肠杆菌的刮取过程中,它们的量一定要适中,以免过多影响后期观察结果;
3、再者,涂片操作结束后,通过酒精灯的烘烤将细菌固定,要注意控制烘干的程度,防止细菌全被烧死;
4、接下来的染色过程中,注意各染色剂染色的时间长度,尤其是95%乙醇脱色的时长,18秒为适宜时长;
5、最后,就是吸干水分,注意油镜的使用,先在低倍镜下找视野,再转成高倍镜、油镜。
关键步骤:我认为是95%乙醇脱色的这一步。因为如果脱色过度,会使革兰氏阳性菌呈假阴性,以致观察时整个视野都是红色;如果脱色不够,会使革兰氏阴性菌呈假阳性,以致观察时整个视野都是紫色,影响观察结果,干扰实验。
七、实验小结
这次实验让我真真正正感受到了做实验的乐趣。每一个操作步骤都必须精准地完成,少有偏差,就会对实验结果产生很大影响,就比如我第一次试验就是脱色时间较长,用了20秒,以致油镜观察时,视野全是红色;第二次试验则是脱色时间较短,只能依稀看到一点被染成
红色的大肠杆菌;第三次则吸取教训,把握每一步,最后看到了紫红相间的视野。期待下一次实验课。