生物物质分离工程实验(10级版本)

生物物质分离工程实验

实验须知：

1、认真预习理解每个实验的目的、原理、操作关键步骤和注意事项。

2、按时上课，迟到20分钟以上者建议重做实验；上实验课时须带实验指导、记录本和笔等。

3、分组后应固定，不能随意更换，不大声喧闹，遵守实验室规则。

4、实验前由教师讲解实验原理、实验具体操作方法以及如何写实验报告。

5、每次实验结束，每组的实验用具要清洗，并却待老师检查实验结果后，方能离开实验室。

6、学生每次实验要写出规范实验报告，报告数据必须如实记录。

7、教师根据实验操作情况、打扫卫生情况、实验报告及最后考核给出成绩（总分100份）。

（说明：生物工程专业本课程实验总学时为32个，因此安排11个实验

生物技术专业本课程实验总学时为16个，因此安排6个实验，做前6个实验）

2012年2月

实验一 有机溶剂萃取法中pH 对表观分配系数的影响（第一次实验）

一、实验目的和要求

1. 通过实验，加深对表观分配系数的理解并掌握其测定方法。

22. 以红霉素为实验对象，了解pH 在萃取工艺中的重要性。

二、实验原理

1. 红霉素为大环内酯类抗生素，呈弱碱性，在不同pH 条件下，在水溶液和有机溶液中溶解度不同，故能达到不同程度的分配。

表观分配系数是指在一定温度和压力下，当分配达到平衡时溶质在萃取相和萃余相中总

浓度之比，可通过实验方法测定。对于弱电解质，溶液的pH 对表观分配系数影响很大。一元弱碱性物质溶液pH 对表观分配系数K 的关系式见式（1-6-4）

K =K 0 1+10pK -pH

式中：K 0——热力学分配系数，在一定的温度和压力下是常数

pk ——化合物电离平衡常数的负对数

由上式可知，随溶液pH 升高，K 值增大，有利于红霉素萃取到有机溶剂中。反之，K

值减小，可将红霉素从有机相反萃取到水相。

2. 利用红霉素在冰醋酸中被浓盐酸水解后，与对二甲氨基苯甲醛形成有色物质，并在486nm 波长处有最大吸收值的特性，可测定其化学效价，从而计算出表现分配系数。

三、实验器材与试剂

（一）器材

精密电子天平，60ml 分液漏斗，分光光度计，恒温水浴锅，pH 酸度计，移液管，烧杯，量筒，试管，50ml 容量瓶，称量瓶和温度计等。

（二）试剂

红霉素成品，乙酸丁酯或乙酸乙酯，氯化铵，氨水，95%乙醇，冰醋酸，浓盐酸，对二甲氨基苯甲醛等。

四、操作方法

（一）溶液配制

1.pH9.0氯化铵缓冲液：称取NH 4Cl 固体70g ，溶于蒸馏水中，加浓氨水48ml ，再用蒸馏水稀释至1L 。

2. 红霉素原液：

A 液：称取红霉素成品25mg 于小烧杯中，加入2ml95%乙醇，溶解后，用去离子水稀释并

定容至50ml 。测pH 值（用pH 酸度计或精密pH 试纸）。

B 液：称取红霉素成品25mg 于小烧杯中，加入2ml95%乙醇，溶解后，用pH9.0氯化铵缓

冲液稀释并定容至50ml 。测pH 值（用pH 酸度计或精密pH 试纸）。

3. 显色剂：取对二甲氨基苯甲醛适量，加冰醋酸溶解使成0.5%（W/V）的溶液。

4. 红霉素标准溶液：精密称取红霉素标准品适量，加95%乙醇溶解，制成0.2mg/ml的溶液。

5. 盐酸-冰醋酸混合液：盐酸、冰醋酸按体积比为2：1的比例配成。

（二）萃取法测定表观分配系数

1. 将上述已配制好的红霉素A 液和B 液各吸取15ml 于2只分液漏斗中，再分别加入15ml 乙酸丁酯或乙酸乙酯，振摇10min 。

2. 静置片刻，使其分层，放出下层水相（萃余液），用pH 酸度计或精密pH 试纸分别测定其pH ，并测定操作温度。

3. 用下述方法测定原液A 和B 以及2只分液漏斗下相液（萃余液）的化学效价。

4. 用下式计算不同pH 的表观分配系数：

k =原液效价-萃余液效价 萃余液效价

（三）红霉素的化学效价测定方法

1. 标准曲线的绘制：

在移液管中分别吸取红霉素标准溶液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5ml 分别置于试管中，

加冰醋酸4.0ml ，显色剂1.0ml ，再加盐酸-冰醋酸混合液至总体积为10ml ，摇匀，置30℃水浴锅中保温10min （温度时间要准确，颜色为红色），取出，冷却后在486nm 波长下比色，用其余的试剂作为空白比照。以吸光度值（A ）为纵坐标，吸取的样品量（mg ）为横坐标作图，并线性回归。

2. 原液效价和萃余液效价的测定

（1）取红霉素A 、B 原液各0.5ml ，置于试管中，按标准曲线的操作方法，比色后根据标准曲线计算原液效价。

（2）另取溶剂萃取系统中的二个萃余相若干ml ，同上操作，比色后根据标准曲线计算原液效价。参考值A 萃余相取1.5-2.0ml ，B 萃余相取3ml 左右。

2. 测定A 、B 两种萃取系统中萃余液的pH. （如果pH 计不稳定，改为精密的pH 试纸）

五、结果分析与讨论（试验报告上要预留空间，等理论课学过后再补上）

1. 计算不同平衡pH 时的表观分配系数K 和红霉素的真分配系数K 0.

2. 根据红霉素的理化性质，分析pH 影响其表观分配系数K 值的原因。

实验二 双水相萃取系统的相图制作（第一次实验）

一、实验目的和要求

掌握用浊点法制作双水相系统相图的方法，加深对相图的认识。

二、实验原理

两水相形成的条件和定量关系可用相图来表示，相图是研究双相萃取的基础。相图是一

条双节线，当成相组分的配比取在曲线下方时，系统为均匀的单相，混合后溶液澄清透明，称为均相区；在曲线的上方时，能自动分成两相，称为两相区；若配比取在曲线上，则混合后，溶液恰好从澄清变为混浊。

三、实验试剂和器材：

（NH 4）2 SO 4溶液、PEG400、蒸馏水、漩涡振荡器（或大试管）、微量滴管装置（或带

刻度滴管，滴定记录滴数，换算成体积）、电子天平、微量注射器、大试管、移液管等

四、实验步骤

1、 精确配置43.00％（g/ml）的（NH 4）2 SO 4溶液，测定其密度为1.172 g/ml。

2、 精确称取PEG400液体0.700g 加入干燥的试管中，按表格第1号数据，用移液管加入

0.5ml 蒸馏水（水的密度按1g/ml计算），再缓慢滴加已配制好的（NH 4）2 SO 4溶液，并

不断在混合器上混合，观察溶液的澄清程度，直至试管内溶液开始出现混浊为止（呈雾

状，不是沉淀），记录（NH 4）2 SO 4溶液的加入量（ml ），并根据密度值求出重量（g ）。

（注意要缓慢滴加，不要滴过，否则又要重新称量）

3、 然后，按下表的第2号数据加水，使其澄清，继续向试管滴加，使其再次达到混浊，如

此按下表3、4······反复操作。

4、 计算每次达到混浊时PEG 在系统总量中的百分含量（％），以PEG 的重量百分比浓度为

纵坐标，以（NH 4）2 SO 4的重量百分比浓度为横坐标作图，即得到一条双节线的相图。

（按下表数据加入、记录和计算）

（一般到第5次以后就较难观察，少数组可滴至第8次，但至少要加5次）

五、结果分析与讨论

简述相图的特点和作用？

实验三 双水相萃取系统中高聚物和盐对相体积比的影响

（第二次实验）

一、实验目的和要求

1、 了解双水相系统形成的机理及常用的双水相系统。

2、 掌握双水相系统中相比的测定方法。

3、 巩固离心机的操作方法及注意事项。

二、实验原理

双水相系统通常是由水溶性的两种聚合物组成或一种水溶性聚合物与一种盐组成, 与一

般分离纯化技术相比, 双水相技术具有处理容量大、能耗低、易连续化操作和工程放大等优点，在蛋白质、酶、核酸等生物大分子的分离纯化等方面受到广泛重视，是一种有发展潜力的易于工业化应用的生物分离技术。

常用的双水相系统有：聚乙二醇（PEG ）/葡聚糖（DEXTRAN ）、PEG/磷酸盐、PEG/硫酸铵等。分成两相后，上下相体积比称为相比，相比增加，上相和下相相对组成的差别就增大，这将会极大地影响产物如酶在两相中的分配系数，使酶富集于上相。

三、实验试剂和器材：

（NH 4）2 SO 4固体、PEG400液体、PEG4000固体、糖化酶滤液（浓度为5%~10%均可）、 蒸馏水、带刻度离心管、电子天平（或台秤）、台式离心机等

四、实验步骤：

1、在四只10ml 刻度离心管中，用电子天平准确称取以下药品到每个离心管中。

（1） （NH4）2 SO4固体1.30g ， PEG400液体2.00g

（2） （NH4）2 SO4固体1.30g ， PEG4000固体2.00g

（3） （NH4）2 SO4固体1.50g ，PEG400液体1.80g

（4） （NH4）2 SO4固体1.10g ， PEG4000固体2.20g

先把PEG4000固体称好后碾碎再加到离心管中，这样比较好溶解。

2、然后再用移液管分别在上述四只试管中各加入糖化酶上清液总量为8.00g 。

3、旋紧试管口，用力振摇数分钟，使（NH 4）2 SO 4或PEG4000固体完全溶解，并使两相，然后加水，直到充分混合，以使酶在两相中的分配达到平衡。

4、用台式离心机3000转/分钟离心分离10 min 后，应观察到明显两相。（注意离心前对角线上的离心管一定要先平衡，若不平衡，可在套管中滴加少量水；再者，离心机转速在启动前打到零挡，启动后再慢慢加速到3000转/分钟，离心机停止转动前不能打开离心机的盖子）。

5、分别读出上、下相体积，并求出四个相体积比R 值（即R1、R2、R3、R4）。四只离心管的上下相糖化酶的含量的测定，由实验四、五来完成。

五、结果分析与讨论

1、简述双水相系统的主要应用？

2、相比对分配系数有何影响？

实验四 双水相萃取系统中相体积比对蛋白质分配系数的影响

（第二次实验）

一、实验目的和要求：

1、 掌握蛋白质在双水相系统中分配系数的测定方法。

2、 了解蛋白质与考马斯亮蓝的显色反应原理及应用。

3、 进一步巩固可见分光光度计的操作及制作标准曲线。

二、实验原理：

双水相萃取技术是分离纯化蛋白质混合物等生物大分子的有效方法。利用生物物质在两

相中不同的分配，可以实现它们的分离；生物大分子在双水相中上相和下相的浓度比被定义为分配系数（K =C t /C b ）；分配行为受聚合物分子大小、成相浓度、PH 、无机盐种类等因素

影响。

考马斯亮蓝与蛋白质可结合形成蓝色复合物，在595nm 有最大光吸收，并且在低浓度

时，吸光值与蛋白质浓度服从比尔定律。

三、实验试剂和器材：

牛血清蛋白溶液、考马斯亮蓝染色液（G-250）、蒸馏水、相体积比实验中分离得到的上下相、可见分光光度计、恒温水浴锅、移液管、试管及试管架等

四、实验步骤：

（1）制作标准曲线：

①取6支试管，用移液管分别准确加入牛血清蛋白溶液（120μg /ml）体积为0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00ml ，然后均用蒸馏水稀释至1.00ml 。

②再分别加入5.00ml 考马斯亮蓝染色液，混匀。

③于25℃±1℃的恒温水浴锅中保温10min （为防止试管歪倒或混淆，可把水浴锅盖子打开，将试管同试管架一起水浴）。

④冷却后，于595nm 进行测定吸光值，以装有1.0ml 蒸馏水的试管为对照。

⑤然后，以以试管中中蛋白质总量（μg ）为横坐标，以相应的吸光值（OD 595nm ）为纵坐标作图，得标准曲线。（注意所得6点至少应有3点在同一直线上，否则标准曲线不可用，应参照其他组线性较好的标准曲线进行计算）

（2）样品测定：（若颜色太深，一般要重新取样品再做）

上相溶液：用吸管吸取上相液Xml ，蒸馏水定容至1.00ml ，按（1）法测定吸光值。

下相溶液：用吸管慢慢插入离心管底部，吸取下相液Yml ，蒸馏水定容至1.00ml ，按（1）法测定吸光值。（以上样品取的ml ，往往要根据具体情况来调整。参考值：1、3只刻度离心管，上相取0.1ml ，下相取0.4 ml，2、4只刻度离心管，上相取0.3ml ，下相取0.3 ml） 可按下表操作：

五、结果分析与讨论

1、相比和分配系数如何影响蛋白质的收率？

2、要想获得准确实验结果，应注意哪些问题？

3、PEG 分子量如何影响蛋白质的分配系数？

实验六 离子交换树脂的预处理及总交换容量的测定（第三次实验）

一、实验目的和要求

1、通过实验加深对离子交换树脂的重要性能之一—总交换容量的认识。

2、掌握离子交换树脂的作用原理。

3、学会离子交换树脂的预处理方法。

4、熟悉静态法、动态法测定离子交换树脂总交换容量的操作方法。

二、实验原理

交换容量是离子交换树脂质量的重要标志，本实验测定的是离子交换树脂的总交换量也

叫最大或极限交换量，它是指树脂经过100℃/105℃干燥至恒重后，每克或水中每ｍＬ树脂具有的可交换离子的总数，单位为mol ／克（干树脂）或ｍＬ（湿树脂）即（mol/g或mL ）

离子交换树脂交换量最简单的测定方法是酸碱滴定法。氢型阳离子交换树脂与碱作用时

＋生成水，为一不可逆反应、故可用于静态法测定交换容量。 ＲＨ→ＲＮａ＋Ｈ２Ｏ

阴离子交换树脂不能采用类似的方法测定，应用氯型树脂，当它与Ｎa ２ＳO ４作用时，生成Ｎa Ｃl ，这一反应为可逆反应，故宜采用动态法测定树脂交换容量。

Ｒ（＝NHCl ）２＋Ｎa ２ＳO ４=Ｒ（＝ＮＨ）２ＳO ４＋２Ｎa Ｃl

－根据滴定流出液中Cl 含量来测定其总交换容量。

三、试剂与器材

1、试剂：５％ＮaOH 、５％ＨCl 、0.1M Ｎa Ｃl 标准溶液、１M ＨCl 标准溶液、１M Ｎa ２ＳO ４溶液、甲基橙指示剂、Ｋ２Cr Ｏ４指标剂、蒸馏水、0.1MAgNO3标准溶液、732阳离子交换树脂、717阴离子交换树脂、330弱碱环氧系阴离子交换树脂。

2、器材：恒流泵、层析柱、滴定管、精密天平、烘箱、容量瓶、三角瓶

四、操作方法

1、离子交换树脂预处理（老师已经做了）

分别称取２ｇ732，717树脂，加水倒入层析柱中，流加50mL ５％NaOH 溶液，流速１

滴／秒，结束后滴加100mL 去离子水，流速可大一些，结束后再流加50mL ５％ＨCl 溶液，流速１滴／秒，最后流加100ｍＬ去离子水，如此重复三次。

2、静态法测定732＃离子交换树脂交换量

（１）精确称取处理好并抽干的氢型阳离子树脂732＃１克，60℃下烘干至恒重，按下式计算含水量

w %=w 1-w 2⨯100%w 1 其中：W1-----烘干前树脂量 W2-----烘干后树脂量

（２）另取处理好的树脂１克放入三角瓶中，吸取40 mL 0.1M NaOH标准溶液加入树脂中，放置24 hrs (实际放置2hrs 左右) 、要求树脂全部浸入溶液中，然后用吸管分别取出10 mL放入二只三角瓶中，以甲基橙1~2滴作指示剂，用0.1M ＨCl 标准溶液滴定溶液由无色变

为红色（刚好至砖红色，约7 mL左右）为滴定终点，取两次滴定的平均值，按下式计算732树脂交换总量。

50N 1-5N 2V 2

总交换容量（mol/克干树脂）＝G (1-W )

其中：G ――湿树脂总量（克） W ―树脂含水量

50—0.1M NaOH 标准溶液的体积（实际40mL ） N1―0.1MNaOH 标准溶液的摩尔浓度 N 2―0.1M HCl 标准溶液的摩尔浓度 5—总交换溶液体积/取样检测溶液体积的倍数（实际为4倍） V 2―0.1MHCl 标准溶液的用量（mL ）

3、动态法测定717＃离子交换树脂交换量

（１）精确称取处理好的并抽干的氯型阴离子树脂717＃１克，105℃下烘干至恒重，按下式计算含水量（W ）

（２）另取１克树脂，加水装入柱中，装柱时应注意不应使树脂层中有气泡存在，然后通入１N Na ２SO ４溶液进行交换，用250mL 三角瓶收集流出液，流速约为80滴/min，直到氯离子全部交换下来为止，量出流出液的总体积（要参加计算），然后吸取25mL 流出液，用0.1M AgNO3溶液滴定（约1-3 mL），以K 2CrO 4为指示剂，溶液由淡黄色变为红色为滴定终点，取两次滴定平均值。（当流出液为200ml 左右时，接一滴流出液在黑色比色板上，加一滴AgNO3， 看是否出现有白色沉淀，若有沉淀，则继续交换，若无，则表示交换完全，停止交换）

计算：

10NV

总交换容量（mol/克干树脂）＝G (I -W )

其中：V ――AgNO 3用量（mL ） N ―――AgNO 3当量浓度

G ――湿树脂重（g ） W ―――树脂含水量（％）

10——流出液总体积/滴定用流出液体积25 mL（视具体情况而定，不一定是10倍）

（3）330弱碱环氧系阴离子交换树脂的总交换容量的测定方法同步骤（2）。

（Na ２SO ４溶液约150 mL）

五、结果分析与讨论

1、阴离子交换树脂为什么一般采用氯型树脂并用动态法测定其总交换容量

2、两种方法中,HCl 、AgNO3标准溶液时起的作用是什么？写出方程式？

3、717和330树脂总交换容量的测定方法有什么不同吗？

实验七 大网格吸附树脂吸附等温线的制作（第三次实验）

一、实验目的和要求

1. 了解大孔吸附树脂吸附的原理。

2. 学会吸附等温线的制作。

二、 实验原理

固体从溶液中的吸附，是溶质和溶剂分子争夺表面的净结果，即在固液界面上总是被

溶质和溶剂两种分子占满。如果不考虑溶剂的吸附，当固体吸附剂与溶液中的溶质达到平衡时，其吸附量m 应与溶液中溶质的浓度和温度有关。当温度一定时吸附量只和浓度有关，

m=f(c),这个函数关系称为吸附等温线。吸附等温线表示平衡吸附量，并可用来推断吸附剂结构、吸附热和其他理化特性。

本实验采取XAD 大孔树脂对水溶液中苯酚的吸附行为来绘制吸附等温线。

三、试剂与器材

试剂：苯酚、去离子水、XAD 大孔树脂

仪器：1L 容量瓶一个、250ml 容量瓶5个、250ml 锥形瓶5个、紫外及可见分光光度计、 摇床

四、 操作方法

1. 大孔树脂的预处理（老师已处理）

将新购的大孔树脂放在烧杯中，加入足量的水，使其溶涨至体积不在增加为止，然后倒入内有少许水的交换柱，使管内树脂量不超过管长的 1/2以上，水在柱内的高度没过树脂。装好柱后，先缓慢地让水从柱的底部流入反洗，并逐渐加速，使树脂全部移动，直至树脂内的气泡全部赶出，同时悬浮不洁 物、破碎及过小颗粒从管顶逸出为止。然后再用甲醇或95%乙醇或丙酮浸泡24h 后再上柱用95%乙醇冲洗，直至无色并澄清后，再用水洗至无醇味即可，也可将树脂与有机溶剂一起在水浴上回流，直到洗涤液加水混合后不呈白色浑浊为止，最后用水洗掉所用的有机溶剂，备用。

2. 苯酚标准曲线的建立

准确称取1g 苯酚置于1L 容量瓶中，用去离子水定容。以其为母液再配制浓度分别为、10、20、30、40、50mg/L的苯酚水溶液250ml 。用紫外及可见分光光度计在270nm 处检测溶液的吸光度。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制出标准曲线。

3. 取5个250ml 的锥形瓶，分别加入干燥的XAD 树脂0.25g ，然后分别加入质量浓度为10、20、30、40、50mg/L的苯酚溶液各100ml 。以150r/min的振荡速度在25℃下振荡24h (实际0.5 hr)以上（或用手摇瓶0.5 hr以上）。

3. 振荡完以后分别取样，在270nm 处检测苯酚的残留浓度。

平衡吸附量用下面公式计算：

m=(C0-C t )V/M

式中：m 为平衡吸附量，mg/g；C 0为溶液的初始浓度，mg/L；C t 为吸附平衡后溶液的浓度，mg/L；V 为溶液的体积，L ；M 为树脂的重量，g 。

4. 为横坐标，平衡吸附量为纵坐标作吸附等温线。

五、 结果分析与讨论

1. 说明大孔吸附树脂的吸附原理？

2. 操作过程中应注意的问题？

本实验用树脂含水量测定：

732型：40%；330型：32%；717型：39.8%；大孔吸附树脂：24.6%

实验八 鸡蛋清溶菌酶的分离与纯化（第四次实验）

一、实验目的和要求

掌握从蛋清制备溶菌酶的原理和方法（等电点沉淀和盐析法）。

二、实验原理

溶菌酶存在于植物（植物浆）及动物（蛋清、白血球、泪液、脾脏及鼻粘膜处）组织中。 蛋清取材方便，溶菌酶含量丰富（可达0.3％），实验室及生产中均以蛋清为材料提取溶菌酶。溶菌酶作用于粘多糖，使其糖苷键水解，因此可溶解以粘多糖为主要成分的细菌细胞壁，起到杀菌的作用。 pI 为10.8-11.3

由于蛋白质在等电点时溶解度最低，所以蛋白质的沉降在等电点附近最为显著。若控制溶液的pH 在等电点附近，并增加盐的离子强度，使蛋白质处于沉降前的“临界状态”，在适当的温度下，静置若干时间，蛋白质会以结晶的形式从溶液中析出。加入晶种，能控制晶体的形状、大小和均匀度，若结晶液浓度太低而结晶发生困难时，可适当加入些晶种，能使结晶顺利进行。

三、实验试剂和器材：

（1）试剂：新鲜蛋清的pH 值大于8才能提取溶菌酶

新鲜蛋清、NaCl 、1M 的NaOH 溶液、1M 的盐酸、五氧化二磷、丙酮、3％醋酸

溶菌酶晶种（5％的无定形溶菌酶溶液10ml ，加入NaCl 为0.5g ，再用1M 的NaOH 溶液

调pH 至9.5－10.0，4℃静置5－6天，溶菌酶即结晶出来）等

（2）器材：

组织捣碎机（或电动搅拌机）、纱布、大烧杯、玻璃棒、冰箱、pH 试纸、真空干燥器、

多用循环水真空泵、布氏漏斗等

四、实验步骤

1、 生产工艺路线：

已称重的烧杯，再称出蛋清和蛋黄的总重量，蛋清要用量筒量出体积） 2、 操作方法：（3人一组，每人1个鸡蛋，分离蛋清和蛋黄备用，3个蛋清和蛋黄分别倒入

（1） 分离蛋清和蛋黄：将蛋清与蛋黄分开，除去脐带块。并称蛋清质量W 和量其体积V 。

（2） 搅拌蛋清：新鲜蛋清收集后用组织捣碎机（或电动搅拌机）缓慢搅拌5min （以不起

大泡泡为度，避免酶受剪切力作用被破坏），或直接用玻棒轻轻搅拌半小时左右（，

再用纱布过滤，取滤液备用。不做）

（3） 加NaCl ：每小组按20ml 蛋清液：1g NaCl 的比例加入NaCl 固体（注意NaCl 要研

磨碎，一点点加，边加边缓慢搅拌，要防止局部盐浓度过高导致蛋白质变性），搅拌至完全溶解。

（4） 调pH 值：NaCl 完全溶解后，逐滴加入1mol/L的NaOH （一定要缓慢并均匀，边加

边缓慢搅拌，防止局部过碱，蛋白质变性），调溶液pH 为9.5－10.0。（用pH 酸度计或精密pH 试纸调）

（5） 加晶种：在碱化的蛋清液中，滴加少量溶菌酶晶种，置于4℃冰箱中，静置一周左

右，观察溶菌酶结晶的出现。（因溶菌酶浓度太低晶体不容易析出，每个小组写好标记再放入冰箱，以免混淆）。

（6） 必要时可重结晶：一周后，离心收集溶菌酶粗品，离心机转速4000rpm/min，离心

10min 。收集溶菌酶粗品，称重（用于计算湿溶菌酶粗品的得率）。（溶菌酶粗品用3%的醋酸调溶液pH 到4－4.5，晶体溶解后再4000rpm/min，离心10min ，除去不溶物，得上清液。按上述方法再加入NaCl ，并用1mol/L的NaOH 调溶液pH 为9.5－10.0后，于4℃冰箱中，静置一周，进行重结晶。此部分省略）

（7） （布氏漏斗抽滤收集结晶，冷丙酮洗涤晶体除去多余水分，在P 2O 5的真空干燥器中

进行真空干燥（干燥器中可放一盆石蜡屑，以便吸收除去剩余的丙酮），干燥后得到溶菌酶的结晶成品，称重，计算得率。）此步骤省略

五、结果分析与讨论：

1、 在碱化的溶菌酶液中为什么要加入晶种？如何制得溶菌酶晶种？

2、 总结本实验的关键步骤及注意事项？

实验九 蛋黄中卵磷脂的分离纯化和定性鉴定（第四次实验）

一、实验目的和要求

1、 了解卵磷脂的性质。

2、 学习提取卵磷脂粗品的方法。

二、实验原理

机体的各种组织和细胞均含卵磷脂。在蛋黄（约10％）、神经、精液、脑髓、骨髓、肾上腺、心脏、蘑菇和酵母等组织内含量很高。卵磷脂分子中具有亲水基团和疏水基团，卵磷脂具有降低表面张力的作用；卵磷脂被誉为与蛋白质、维生素并列的“第三营养素”，蛋黄卵磷脂可将胆固醇乳化为极细的颗粒，这种微细的乳化胆固醇颗粒可透过血管壁被组织利用，而不会使血浆中的胆固醇增加，可作为药物用于动脉粥样硬化等疾病的综合治疗。

纯卵磷脂（即磷脂酰胆碱）为白色蜡状块，不溶于水，易溶于醇、氯仿、乙醚和二硫化碳中，但不溶于丙酮，利用后一性质可与中性脂肪分离。

三、实验试剂和器材：

（1）试剂： 新鲜蛋黄、95％乙醇、10％的NaOH 溶液、丙酮、乙醚

（2）器材： 磁力搅拌机（或玻棒）、减压真空浓缩装置、恒温水浴锅、冰箱、多用循环水真空泵、布氏漏斗、玻璃漏斗、玻璃棒、小烧杯等

四、实验步骤

1、 制备工艺路线：

2、 操作方法：

① 抽提：按照实验八剩下的蛋黄（3个）的质量，加入2倍质量的预热至35℃－40℃的95％乙醇，可按体积、密度计算（不需很精确）（注意一定要缓慢的加入，边加边缓慢搅拌，否则会出现沉淀得不到抽提液），加入乙醇后，不断搅拌10－12小时（由于时间关系，具体实验时改为1.5~2小时），离心得上清液（4000r/min，5分钟）。

② 浓缩：将上述上清液减压真空浓缩或沸水浴蒸发，（要做好标记，注意要防止盛有抽提液的瓶子歪倒在水浴锅，造成浪费）至原体积的1/6左右。

③ 去杂：在搅拌下加入浓缩后等体积的乙醚（要缓慢），不断搅拌并放置2小时（由于时间关系，具体实验时改为10分钟），使不溶物沉淀完全。过滤除去杂质，收集上清液（乙醚澄清液）。注意事项同步骤（1）。（由于时间关系，该步骤省略）

④ 沉淀卵磷脂：在急速搅拌下加入与上清等体积的预冷丙酮（丙酮在冰箱里），即开始出现卵磷脂沉淀，用滴管吸取，做鉴定。（抽滤，收集并再用丙酮洗涤，挥发去乙醚丙酮残液，真空干燥得块状成品。不做）

⑤ 定性鉴定卵磷脂：取制品少量置于试管中，加入20％的NaOH 溶液约2ml ，于沸水浴煮沸，卵磷脂分解生成胆碱，胆碱在碱的作用下，形成三甲胺。注意：三甲胺有明显的鱼腥味。

五、结果分析与讨论：

5、 第一步为什么要用预热至35℃－40℃的95％乙醇抽提产品？

6、 浓缩是为了去水还是去醇？为什么要浓缩？

实验十、十一 苹果中多酚类物质的分离提取及其定量检测

（第五次实验）-----设计性实验

一、实验目的

1、了解苹果多酚类物质的性质及作用

2、熟悉苹果多酚的提取及鉴定方法

二、实验原理

性质：苹果多酚粉末呈黄褐色或淡褐色，其水溶液呈黄褐色，有微弱的苦味和涩味。多酚类物质易溶于乙醇、甲醇、丙酮等有机溶剂，苹果多酚同时还具有优良的耐热性和耐酸性，在pH 在2～10、温度为100℃条件下，苹果多酚的分解率很低，易于保存。

提取：多酚类物质在乙醇、甲醇、丙酮等有机溶剂中都有较高的溶解度，综合考虑试剂毒性及成本等，最常用的方法是用乙醇作为溶剂浸提。有机溶剂法具有设备简单、操作方便和成本低廉等优点，（最佳提取工艺为: 乙醇浓度60%，提取时间为120min ，温度为60℃，料液比1∶6，提取一次, 最大提取率为3.80mg /g）

测定：过量酒石酸铁在多酚溶液中与多酚反应生成稳定的紫褐色络合物（可作鉴定），溶液颜色的深浅与溶液中多酚的含量成正比。因此可通过比色法540nm 定量测定多酚, 用没食子酸制作标准曲线，多酚含量在5～30μg 范围内与吸光值呈良好的线性关系。

三、实验器材和试剂

试剂：酒石酸钾钠（C4H4O6NaK ·4H2O ），硫酸亚铁（FeSO4·7H2O ），磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O ），

磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O ），没食子酸，维生素c ，成熟苹果一个，60%乙醇。

酒石酸铁溶液：称取硫酸亚铁（FeSO4·7H2O ）1g 和含4个结晶水的酒石酸钾钠（C4H4O6NaK ·4H2O ）5g, 混合后加蒸馏水溶解，定容到1000mL 。（根据实际用多少来决定，不一定要配那么多）

pH 值7.5 的磷酸盐缓冲液：称取磷酸氢二钠（Na 2HPO 4·12H 2O ）60.2g 和磷酸二氢钠（NaH 2PO 4·2H 2O ）5.00g ，混合后加蒸馏水溶解，定容到1000mL 。

没食子酸标准溶液的配制：称取没食子酸0.5g 溶于10ml 去离子水中，用1000ml 容量瓶定容，

0.5 mg/ml

器材：分析天平，可见光分光光度计，1000ml 容量瓶3个，试管10只，烧杯，滴管，三角瓶

一个，100ml 量筒一个，50ml 量筒一个，研钵，玻璃棒，恒温水浴锅，漏斗，纱布，塑料膜，橡皮筋。

四、实验步骤

（一）标准曲线制作

分别取0.5 mg/ml没食子酸标准溶液0，1ml ，1.5ml ，2ml ，2.5ml ，3ml ，4ml ，5ml 于试管中加水稀释至5ml ，再分别取得到试液1mL 于试管中，加入蒸馏水4mL 和酒石酸铁溶液5mL ，摇匀，再加入pH 值7.5 的磷酸盐缓冲液稀释至25ml ，选择540nm 波长和1cm 的比色杯测定吸

光值，以吸光值为纵坐标，多酚类质量为横坐标(ug）绘制标准曲线。

（二）苹果多酚类的提取和含量测定

1、预处理：将成熟的新鲜苹果洗净加入少量Vc 捣碎，称取50g 样品。

2、提取：量取100ml ，60%的乙醇，加入装有苹果泥的三角瓶中，用塑料膜封口，于60℃恒温水浴锅中搅拌浸提2h 。(此步骤需提前准备)

3、浓缩：2h 后取下塑料膜，使乙醇挥发殆尽（常温下很难挥发，可在沸水浴中加热挥发），（用3层纱布过滤或者）4000转/分钟离心10分钟，量取上清液1ml （稀释至5ml ，若浓度低则不稀释）作为待测样品。

4、测定：吸取待测样品1mL 放在试管中，加入蒸馏水4mL 和酒石酸铁溶液5mL ，摇匀，再加入pH 值7.5 的磷酸盐缓冲液稀释至25ml ，以蒸馏水代替样品试液，加入同样的试剂作空白，选择540nm 波长和1cm 的比色杯测定吸光值。

五、结果分析与讨论

1、计算苹果中多酚物质的含量

2、本实验的关键步骤是什么

2、评价实验结果，提出改进的意见

注意：最后一次实验，要观察上次做的溶菌酶结晶实验结果，并把实验现象和实验结果（把粗的溶菌酶离心后收集沉淀，并称重，计算溶菌酶的湿重得率）写到实验八里。