基因表达水平的稳定性及其应用评价
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文章编号:100r7—4287(2009)06—0716—05
相对定量RT.PCR法中内对照基因表达水平
的稳定性及其应用评价
梁志超1,陈江华2,刘志安2,刘敏1,蒋明3,赵建华2。
(江苏省肿瘤医院1.检验科;2.江苏省肿瘤医院、省临床检验中心;3.胸外科,江苏南京210009)
摘要:目的评价相对定量RT-PCR方法中不同内对照基因表达水平的稳定性及其对靶基因预后判断的影响程度。方法以36例食管癌患者为例,收集其手术前(B-1)、手术刚结束时(BO)和术后第三天(B+3)的外周血样品。利用实时定量RT-PCR技术,分别检测内对照基因Beta-actin和GAPDH在不同时问的表达水平,并以CEAmRNA作为靶基因,比较基于这两种内对照得出的靶基因相对定量结果用于患者预后判断的差异;标准化的绝对定量结果被作为“预后判断的参照标准”。结果在三个取样时间点,两种内对照基因表达水平的标准偏差依次分别为Beta-acfin
mR.
NA:1.44,1.56和1.92;GAPDHmRNA:3.16,3.28和4.04;两者的总体变异程度分别为9.9%和17.3%。术后一年的复发结果表明,绝对定量法和基于Beta-aetinmRNA的相对定量法在预后判断中能够得到一致的结果,而GAPDH
mRNA
的相对定量结果与复发之间未显示统计学意义的相关性(P>0.05)。结论相对定量RT-PCR法中内对照基因表达水平的变异程度低于10%时,才能保证内对照的有效性以及靶基因测定结果的可比性。基因表达研究时应对所用的内对照基因表达稳定性进行前期评估。
关键词:食管癌;内对照基因;Beta-actin中图分类号:R73.3
mRNA;GAPDH
mRNA;实时定量RT-PCR
文献标识码:A
Expressionstabmty0fendogenouscontrolgenesiIlrelativequantitativeRT-PCR
LIANGZhi-cha01,CHENJiang-hua2,删Zhi-an2,et
torySc/ence
and;3.D甲珊删of
oftarget
a1.(1.及妒删ofClinicallaboratory;2.JiangsuCenterofClinicalIzlbora—
Cancer
methodantiitsapptlcationevaluation
Chest
Surgery,Jio嶝u
Hospital,Naming210009,China)
endogenouscontrolgenesanditsinfluence
caIlcer
Oil
Abstract:Objective
prognosisfore
Toevaluatethestabilityofexpressionlevelsofdifferent
the
judgegene.Methods
after
Peripheralbloodsamplesfrom368quanlougesophageal
at
patients
werecollectedbe-
surgery(13-1),immediatelysurgery(130)andthethirdday
were
post-operatively(B+3),respectively.Geneexpressionlevels
ofendogenouscontrolsbcna-actinandGAPDHatalltimepoints
determinedby
a蒯-time
two
quantitativeRT-PCRtechnique.The
was
prognosisvalueofrelativequantitativeresultsoftargetgeneCEAmRNAbasedOiltheAbsolutequantitativeresultswithnormalizationstrategy
were
controlgenes
analyzedandcompared.
Thestandard
used船“references切ndardforprognosisjudge”.Results
deviationsfromBeta-actinandGAPDHexpressionlevelsatabovethreetimepointswere1.44,1.56,1.92and3.16,3.28,4.04,Ie—spectively.Bothtotal
variances
were
9.9%and17.3%.respectively.Thefollow-upofthe36patientsin
OIle
year
showedthatthe
on
consistentprognosisresults
mRNA.Buttheresisof
were
obtainedfortheabsolutequantitativeassayandtherelativequantitativeassaybased
on
beta-aetin
Was
not
statisticallysignificantrelationshipbetweellthequantitativeresultbased
GAPDHmRNAand
thepmgno—
relapse(P>0.05).Conclmionan
endogenous
IntheRT-PCRrelativequantitativeassay,whenthevariancedegreefromtheexpressionlevels
controlgeneislowerthan10%,validityoftheendogenouscontrolgeneandcomparabilityoftargetgene’8quantita。
selectedendogenouscontrolgeneshouldbeen
fiveresultscouldbeensured.Instudiesofgeneexpression,theexpressionstabilityofthea88e鹧edin
advance,
controlgene;Beta-aetinmRNA;GAPDHmRNA;Real-timequantitativeRT-PCR
Keywords:Esophagealcancer;internal
(ChinJ
Lab脚,2009,13:0716)
外周血循环肿瘤细胞的检测有助于肿瘤微转移的早期发现。目前用于检测循环肿瘤细胞的最敏感方法是基于实时荧光定量RT-PCR的方法,其定量
方式又分为绝对定量和相对定量两种类型。绝对定
量法是通过靶基因标准品建立的外标准曲线对样品
中靶基因拷贝值的准确定量,是目前公认方法之一。不过,由于实验成本和流程复杂等问题,在常规应用
受到限制。临床应用最多的是相对定量法,国内普遍采用靶基因与内对照基因的比值来标准化结果,
基金项目:江苏省社会发展科技计划项目(BS2007077)*通讯作者
万方数据
生垦塞熊望堑堂!塑芏鱼旦箜13鲞蔓§翅国外普遍利用癌细胞系建立的标准曲线通过2一心‘
法得到癌细胞的相对数目来标准化结果…。无论采用何种表示方法,相对定量法要想得到一个可靠的结果,内对照基因表达水平的稳定性非常重要;因为它不仅可以有效监控PCR测定的所有步骤,而且对癌细胞靶基因表达水平的校正起到了关键性作用。至今还没有发现或找到适合于所有类型的细胞和组织并稳定表达的、可作为广谱性内对照的参照基因[2-6J。Huggett等【5J强调指出,应当对所选参照基因在使用前进行有效性评估。许多在使用参照基因前并没有考虑到这一点,也未开展参照基因表达水平的波动对实验结果影响程度的评估。
常用参照基因主要有p肌动蛋白(Beta-actin)和3.磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。和细胞内其他基因一样,在某些生理、病理或实验条件下,它们的表达可能也会改变;而所谓的恒定表达其实只是在一定类型的细胞中或实验因素作用下“有范围”的恒定【6]6。为了检验这两个参照基因表达水平的稳定性及其对靶基因定量结果和预后判断的影响程度,基于以前的工作[71,本文检测了两基因在食管癌患者围手术期外周血中的表达变化,并比较了使用绝对定量法以及不同内对照的相对定量法,谁能得到更准确并与预后相关的定量结果。1材料与方法1.1研究对象
2005年1月到8月在本院进行肿瘤切除术,术后病理检查证实为食道鳞状上皮细胞癌的36例患
者为实验组,收集手术前(B一1),手术刚结束(Bo)以
及术后第3天(B+3)的外周血样品;男26例,女10例,平均58.3岁,均有完整的一年随访资料。依据时期本院22例开胸术的良性肿瘤患者在上述三个
时间点的外周血样品作为对照组。1.2试剂与仪器
淋巴细胞分离液为上海恒信化学试剂,TRIREAGENT和RevertAidTM
FirstStrandcDNASynthesis
Center公司。引物和探针均由上海超世生
mRNA序列见文mRNA引物:上游5’一AGCACA.
mRNA作为靶基因,人源食管鳞状
万
方数据一717一
上皮癌细胞系1E一10(上海生科院细胞所)用于将
CEA
mRNA测定结果转化为癌细胞数【7J。主要仪
器:BIO—RADICycle实时荧光定量扩增仪,美国BIO—
TEK分光光度仪。1.3实验过程
经中心静脉穿刺抽取血,置DETA—K2抗凝管
中,用淋巴细胞分离液分离并收集单个核细胞。为避免上皮细胞可能带来的污染,前5毫升血予以废弃。样品提取总RNA后,以1%琼脂糖凝胶电泳鉴
定其质量和紫外测定其纯度和浓度。取2鸠总
RNA逆转录合成eDNA(20肛1),取2阻cDNA(相当于
200
ng总RNA)实时荧光定量PCR扩增内对照基因
和靶基因,条件为:94℃预变性2min,940C变性30s
和50。C退火延伸40s,共45个循环。1.4定量方法
标准化的绝对定量法见文献[7]:该法基于双标
准曲线,首先利用靶基因阳性质粒标准品建立的标准曲线,得到每毫升外周血中CEAmRNA的拷贝
数,然后通过基于TE一10食管癌细胞系建立的第二
个标准曲线将拷贝数换算为每IIll外周血中表达
CEA
mRNA的癌细胞数。
相对定量法中表达CEAmRNA阳性癌细胞数
基于2一心‘方法得到:首先,建立癌细胞系1E.10的
不同癌细胞数目(每5x106个正常人白细胞中分别加入106、105、104、103、102、10和1个rIE.10细胞)与△C.之间的标准曲线,选取中间值103作为基准,根据标准曲线得到对应的标准AC。值(△C¨伽da兀1);其次,分别以Beta.actin和GAPDHmRNA为内对照基因,与靶基因同时扩增,利用靶基因和内对照循环阈
值之间的差值(AC。=C。,。一。一CI,reference)作为相对循
环阈值,样品中表达CEAmRNA阳性癌细胞数(X)
通过公式得到:志=2-(/,c,-ac,.mtd=d’。不同方法得
到的预后结果均为癌细胞数之间的比较结果。2结果
2.1结果的可靠性评价
样品总RNAA260/A280比值在1.9—2.1之间,
RNA标准品的比值为2.09;1%琼脂糖凝胶电泳可
见清晰的28S和18S条带且28S/18S≥1.1。PCR同步扩增同一阳性对照的RNA(未逆转录)和cDNA(经逆转录的RNA),结果显示:只有cDNA出现阳性结果,表明引物特异性良好。对照组中CEA.靶基因
在三个时间点表达水平的95%置信区间上限均低
于样品组中靶基因表达水平的95%置信区间下限,
WTO标准和TNM系统进行临床分期;0一I期13例、Ⅱ期7例、Ⅲ期16例,均无远处转移。收取同一
逆转录试剂盒分别购自美国Fermentas和Molecular
Research
物公司设计与合成,GAPDH和CEA献[7]。Beta-actinGAGCC,I℃GC哪3’;下游5’.GCGATATCATCATC—
TAMRA。以CEACA代GB3’;探针,FAM—CCACACCCGCCGCCAGC可-
一718一
表明靶基冈扩增也具有良好的痛细胞特异性。
2.2
Beta-actin和GAPDHmRNA在食管癌手术前后的表达水平见图1。
内对照基因在食管癌患者外周血中的表达变化
图136例食管癌患者外周血Beta-aetin和GAPDHmRNA在手术前后的表达水平(以Ct值表示)
结果显示,Beta-actin和GAPDHmRNA在手术前异,但是Beta-aetin相对定量结果与绝对定量结果则更为接近。由于大部分患者血中GAPDHmRNA表达水平波动较大并且远低于Beta—actinmRNA的表达水平,使得GAPDH相对定量结果大幅度增高,并使置信区间大幅度变宽。
表1不同内对照基因在手术前后表达
后三个时间点上表达水平的平均值均很稳定。但不
同个体之间,两者的波动程度却存在有显著差异,以标准偏差来衡量,Beta—actinmRNA波动程度明显小于GAPDH
mRNA。Beta.actin
mRNA的总体相对标准
偏差不超过10%,见表l。
2.3基于不同定量方法的靶基因表达水平结果比较
以CEAmRNA为靶基因,不同内对照基因作为
内对照基因—莠幂爵』警巢鬻鬈警}‰标量亲篓:2,
水平变化的相对标准偏差
Beta-actlnGAPDH
8.6
9.4
参照得到的的相对定量结果与绝对定量结果列于表2。结果显示,尽管三种定量结果之间均有显著性差
i1.8
15.615.820.4
表2不同方法得到的表达CEAmRNA阳性癌细胞数比较
2.4基于不同内对照的相对定量结果用于预后判
断的差异
我们以前的工作已证实[7|,表达CEAmRNA的癌细胞数在食道癌术后三天的变化程度与患者手术
后一年的复发显著相关。基于这一发现,为了探讨内对照基因表达水平的波动是否会对靶基因的预后判断产生影响及其影响程度有多大,我们比较了两者与绝对定量结果在预狈0复发上的差异(表3)。
表3采用不同方法得出的CEAmRNA阳性表达水平的变化与复发的关系
*R为患者术后第三天外周血循环癌细胞数与手术刚结束时的癌细胞数的比值(B+3/130)
万方数据
主圈塞堕望堑芏!塑玺鱼旦笙!≥鲞筮i塑
术后一年的随访结果中有11例患者复发。在绝对定量法中∽J,当术后第三天循环癌细胞数与手术刚结束时的癌细胞数比值(B+3/B0)大于0.4时,也即术后第三天癌细胞数回落得较慢时,患者复发风险明显增高。利用Beta-aetinmRNA得到的相对定量结果表明,该比值大于0.3时复发风险明显增高。而以GAPDHmRNA为内对照基因得到的相对定量结果显示,术后三天内癌细胞数的变化程度与患者复发之间不存在显著相关性,表3中给出的是P值为最小时的癌细胞数比值。3讨论
近10年发表在高影响因子杂志上的、研究表达变化的文献分析显示,GAPDH、Beta-actin、18S
rRNA
和28SrRNA被超过90%的研究单独用作参照基因进行定量L8J8。一些研究基于rRNA占总RNA量80%的事实,认为rRNA是RNA定量标准化的最佳选择。但大多数研究则提出,由于rRNA转录易受各种生物因素如有丝分裂和药物的影响,rRNA不能作为mRNA表达且也不能如实反映RNA降解的情
况,以及删A相对于靶基因呈高丰度表达在实时
定鼍数据分析时难以准确减去基线值等原因,18S和28Sriga不宜作为参照基因[8。11]。
目前,实时荧光定量RT.PCR技术普遍采用相对定量法来确定癌患者外周血中肿瘤细胞的存在水平。使用该方法的前提是所用内对照基因的表达水平在不同个体和不同实验条件下具有高度的稳定性。基于这一高稳定性的前提,靶基因的相对测定结果才具有可比性。尽管一些文献已经报道管家基因在一些情况下表达水平变动很大,盲目使用可能会使靶基因表达的微小差异难以发现,甚至可能会引致错误或相反的结论【9]9,但未能引起人们的广泛关注,加强此方面的研究和报道非常必要。在我们的结果中,尽管在三个时间点,Beta—actin和GAPDHmRNA的平均Ct值较稳定,但两者的波动程度却有显著差异,前者明显小于后者。预后数据分析表明,内对照基因的波动程度会对靶基因测定结果的临床应用价值产生影响。我们的结果显示,当这种波动程度不超过10%(Beta-actinmRNA的总体波动程度)时,用不同方法得到的靶基因测定结果所具有的临床意义是一致的,而当这种波动程度达到17%(GAPDHmRNA的总体波动程度)时,靶基因测定结果的临床意义是不可靠的,应当选用其它的参考基因进行标准化处理。这一点在我们对其它类型癌症
患者的测定中也得到了验证。我们收集了37例结
万
方数据一719一
直肠癌患者手术前一天和术后两小时的外周血样品(未列出结果),两个时间点Beta-actinmRNA的Ct平
均值和标准偏差分别为:15.9,15.5和1.3,1.O,
GAPDH
mRNA的Ct平均值和标准偏差分别为:
17.8,17.4和1.1,1.1。总体相对标准偏差分别为:
Beta-actin,7.3%;GAPDH,6.3%。两个内对照基因的表达在结直肠癌患者手术前后都具有较高的稳定性,可用于标准化的目的。Liu等[10]的研究则发现GADPH是最适合于非小细胞肺癌肿瘤组织样本RT—PCR相对定镀检测的参照基因。新近,叶文静等【llJ对老年大鼠不同组织基因表达研究后建议,在基因表达水平分析中至少应该使用两个参照基因,1个
选择18S删A用于对样本总RNA绝对数量进行控
制,另1个选择mRNA型管家基因用来决定靶基因的表达水平,其中心脏和肺组织适用GAPDH,而肾组织适用Beta.actin。与此同时,以上这些结果也说明,不同癌症患者、同一癌症患者不同样本类型及其不同时间点中,内对照基因表达水平的波动是不可忽视的,对内对照基因在使用前进行评估至关重要。
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(收稿日期:2008一ll一11)
文章编号:1007—4287(2009)06—0r720一∞
KiSS.1基因对膀胱癌细胞系T24
生物学行为影响的研究
袁子杰1,杨杰2
(1.长沙市中心医院,湖南长沙410004;2.解放军95988部队医院,吉林长春130062)
摘要:目的探讨肿瘤转移抑制基因KISS-1对膀胱癌细胞TN的生物学影响。方法将构建好的含77lbp大小的基因片段的真核表达质粒peDNA3.1(+)/KISS-1及空载体peDNA3.1(+)用阳离子脂质体介导采用基因转染技术转染膀胱癌细胞T24,观察KISS-IretiNA的表达、细胞生长能力、增殖情况及细胞侵袭力的变化。结果peDNA3.1(+)/
KISS-1成功转染似细胞,KISS-1
mRNA表达阳性,而正常细胞和空载体组为阴性;转染目的基因后细胞生长曲线、平
板克隆形成率与正常细胞及转染空质粒细胞组无显著性差异(P>0.05);转染目的基因后的细胞组穿透Millieell-PCF膜的细胞数较转染空质粒组及正常细胞组明显减少(P<0.05),细胞侵袭能力明显下降(P<0.05)。结论l(iSS-I基因对膀胱癌细胞124的生长、增殖无影响,但可抑制其侵袭力。
关键词:KISS-1;膀胱癌细胞T24;转染;侵袭中图分类号:R737.14
文献标识码:A
S姗y
c^础,咖k
tlle恻influence0fⅪ辫l
gene加bladderclnll弛r
cell峨I"24
YUAN
Z啦!,YANGJie2.(1.The
CentredHospi一
以of
410004,China;2.Ch/nesePL4
95988胧z嘶Hospital,c^叫gc^黼130062,Ch/na)
Ab;h呶:Ob.删ve
Toapproachtheeffectofanti—metastasisgeneKiSS-I
On
thebiologicalbehavior
to
thebladder
cltncer
cell
’I_24.Methods
Therecombinant
eIl州c
expressionpl鹪imid
peDNA3.1(+)/KdSS-l
iIlcluding771
bp
taurgetgenefragn解nt既一
codinghumanKISS-1geneandthevector
peDNA3.1(十)weretran商eetedinto
h山'mnbladdercaJlcercellline124by
lipcIfec枷ne
successfully.StudythecharacteristicsoftheKISS-1transfeeuxteeUsincludingexpressionofKiSS-InllqNA,abilityofgrowth,pmlifem-fionandinvasion.Results
F&SS-1
gene
was
integratedintothegenomicDNAofl24;Theexpre%ionofKISS-1nfflNA
was
positivein
thetran舒eetedgroupandnegativeinpeDNA3.1(+)and
unmmsfeetedgroups.Thecell掣0’汕curveandthefiatcloIle
formation嗽e
beI腑n
thet
mrmfeetedanduntran商eetedgrouphas
no
significant(P>0.05).Millieell
C}lanlberinvasion
assay
sh洲ed
thatcell
mlIll|ber
iIlvadingmmughMilliceU-PCFmter
WaS
significantlydecrieasedintheKISS-1tnm商eetedgroupc伽叩laI甜with
t}l砒int}le
1111・
Ⅱansf.ected
group(P<0.05).CI蹦:l蜮蛐KISS-1
gene咖suppresstheinvasion
ofthebladder
e,qⅡleer
cell724
invm
but
has肿
effect
to
the伊o、讪and
proliferation.
Keywords:KISS-1Gene;BladderCancel"CelllineT24;Tramfeetion;Invasion
(Ch/n.,蹦脚,2009,13:0720)
人类正常心脏、脑、胎盘、肝脏、肺、骨骼肌、肾脏l材料与方法和胰腺组织中均可检测到不同片段长度的硒Ss.
1.1材料
1mRNA,而在多种存在转移的肿瘤组织中表达缺失,
1.1.1质粒与菌株表达载体peDNA3.1(+)本室
表明它是一个肿瘤转移抑制基因,与肿瘤的转移密保存,重组质粒peDNA3.1(+)/KISS.1为本室构建。切相关。膀胱癌易于转移而广泛播散,其生物学行1.1.2细胞株人膀胱癌细胞株1"24购自上海细为的调控是近来的研究热点。我们利用含有KiSS一1胞生物学研究所。
基因编码序列的真核表达质粒转染膀胱癌癌细胞株1.1.3其他试剂RPMll640、胰酶、TrizolRNA提取124,研究此基因对细胞生长、增殖和侵袭能力的影试剂、PCR相关试剂、100
bpDNA
Marker和RT-PCR
响。
试剂盒购自上海生工。Millicell小室购自Amersham
万
方数据