双功能抗体药物研究进展
中国医药生物技术 2014年8月第9卷第4期 Chin Med Biotechnol, August 2014, Vol. 9, No. 4 291
DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.04.009
·抗体药物研究新趋势·
双功能抗体药物研究进展
李锋,黎晓维,沈倍奋
抗体类药物近 20 年来蓬勃发展,目前全球上市的抗体药物已经有 40 多个品种,其治疗领域也从传统的癌症、自身免疫性疾病逐步扩展到抗感染和代谢性疾病等。2013 年全球 10 大畅销药物中有 6 个是抗体类药物,包括 3 个 自身免疫病治疗性药物和 3 个抗肿瘤抗体。单克隆抗体 发展的同时也开启了对新结构、新功能抗体药物的探索, 以期进一步优化抗体药物功能活性。抗体糖基化改造(afucosylation )、抗体-药物偶联(antibody drug conjugate,ADC )、双功能抗体(bispecific antibodies,BsAb )等都是当前抗体药物研发的热点领域。单克隆抗体能够特异性结合靶抗原上特定的表位,其优势在于亲和力高、专一性强。但传统抗体仅结合单一靶点的单一表位,因此其疗效受到一定限制。药理学研究揭示,多数复杂疾病都涉及多种与疾病相关的信号通路,例如肿瘤坏死因子 TNF、白介素 6 等多种促炎症细胞因子同时介导免疫炎性疾病,而肿瘤细胞的增殖往往是由多个生长因子受体的异常上调造成的。单一信号通路的阻断通常疗效有限,而且容易形成耐药性。因此,开发能够同时结合两个不同靶点的双功能抗体及其类似物,长期以来成为新结构抗体研发的重要领域。早期在免疫原性、结构稳定性以及抗体质量控制等方面的不足,限制了双功能抗体的进一步的发展。近年来,上游基因工程抗体和下游生产工艺技术的改进,克服了传统双功能抗体的缺陷,从而推动了多类新型双功能抗体进入临床开发阶段。目前主要在研的双功能抗体从作用机制上可分为双重信号阻断型和抗 CD3+ T 细胞介导的双功能抗体;从结构上可分为由单链抗体或 Fab 区组成的小型抗体和全抗体;从生产工艺上可分为原核或真核表达、单细胞内表达和双细胞系表达结合体外装配等方式。本文就双功能抗体的最新进展进行简要综述。
Fc 结合效应细胞 FcR 受体,Fab 双臂分别结合 T 细胞表面 CD3 分子和癌细胞表面 EpCAM 受体,所以该项技术又称为“三功能抗体”(Triomab )。尽管 catumaxomab 已于 2009 年被欧盟批准上市用于治疗 EpCAM 阳性肿瘤所引起的恶性腹水,但鼠源抗体的高免疫原性大大限制了其临床应用[1]。
为了解决将两个不同的人源化半抗体进行正确装配的问题,研究者们设计开发了多种结构的双功能抗体。首先是将两个单链抗体(scFv )或者两个 Fab 通过肽段 linker 链接,形成双功能抗体片段。具有代表性的是德国 Micromet 公司开发的 BiTE(bispecific T-cell engager)系列产品。该系列产品是将抗 CD3 单链抗体与不同抗肿瘤细胞表面抗原单链抗体通过肽段进行连接获得的[2]。这类抗体结构的优点是分子量小、可以在原核细胞中表达、不需要考虑正确装配的问题;缺点是由于没有抗体 Fc 段,不能介导相应的生物学功能、半衰期短等,因而临床应用受到一定限制。
另外一种可以保留抗体的 Fc 结构域的设计是在正 常抗体轻重链的 N-末端分别再接入另一个抗体的 V L 和 V H ,通过两个抗体可变区结合双靶点,称作 DVD(dual-variable domain)结构抗体。由于引入了额外的抗体可变区,其分子量大于正常 IgG 抗体[3]。
为了避免临床上未知的免疫原性等副作用,双功能抗体应尽量避免引入额外的连接肽段和结构域,采取接近正常抗体的结构。通过改造抗体 CH3 区的氨基酸序列,形成有利于异种半抗体相互配对的结构,可以在构成双功能抗体的同时又尽可能地保持正常抗体的结构。较典型的是“杵臼”结构抗体(knob-in-hole ),具体方法是将其中一个抗体的重链 CH3 区 366 位体积较小的苏氨基酸残基 T 突变为体积较大的色氨酸残基 W ,形成突出的“杵”型结构;同时将另一个抗体重链 CH3 区 407 位较大的酪氨酸残基 Y 突变成最小的丙氨酸 A ,形成凹陷的“臼”型结构;利用“杵臼”结构的空间位阻效应实现两种不同抗体重链间的正确装配。由于抗体轻链通常对其结合活性影响较小,通过两类抗体共用序列相同的轻链,以保证轻链的正确装配。在单细胞系表达此类双功能抗体,分泌的产品正确装配率高达 92%,能够满足规模化生产的要求。但重链 CH3 的这一改构方式降低了抗体结构的稳定性,为了克服这一缺点,通过噬菌体 作者单位:101111 北京天广实生物技术股份有限公司(李锋、黎晓维); 100850 北京,军事医学科学院基础医学研究所(沈倍奋) 通讯作者:沈倍奋,Email :[email protected] 收稿日期:2014-05-16
1 双功能抗体的结构与产生技术
双功能抗体的研究始于 20 世纪 80 年代单克隆抗体技术诞生后。最初的尝试是将 2 株表达不同单克隆抗体的杂交瘤融合,构建 4 倍体杂交瘤。但是,两株异源抗体的轻重链随机装配,理论上体系中会有 10 多种不同组合的抗体存在,为抗体纯化和质控带来了巨大的挑战。目前唯一上市的双功能抗体产品 catumaxomab(商品名 Removab)就是融合来自大鼠和小鼠分别表达抗 EpCAM 抗体和抗 CD3 抗体的杂交瘤细胞株获得的混合型双功能抗体。利用种属间抗体轻重链结合能力的差异以及种属间抗体重链与亲和层析介质蛋白 A 亲和力的差异,catumaxomab 成功实现了高纯度双功能抗体的规模化生产。catumaxomab 的全抗体结构保留了抗体 Fc 结构域介导的生物学功能,抗体
292 中国医药生物技术 2014年8月第9卷第4期 Chin Med Biotechnol, August 2014, Vol. 9, No. 4
展示库技术筛选不同结构,最终将“臼”型结构改进为更稳定的 3 个氨基酸突变(T366S 、L368A 、Y407V )形式[4]。在单细胞系中表达“杵臼”结构抗体,要求两个抗体共用同序列轻链,会在一定程度上影响抗体的亲和力。为了解决不同轻链正确装配的问题,近年来又开发了双细胞系分别表达半抗体、体外装配的新工艺。受到人体 IgG4 抗体在生理条件下自然发生的半抗体随机交换过程的启示,GenMab 公司开发了 FAE(Fab-arm exchange)双功能抗体技术[5]。在两个目标抗体 IgG1 重链 CH3 区分别引入 K409R 和 F405L 两个点突变,就能够形成类似于IgG4 抗体的半抗体交换重排。将突变后的两个不同 IgG1 抗体在两个 CHO 细胞系中分别表达并完成半抗体轻重链间的装配,经过蛋白 A 亲和纯化后,利用温和的氧化剂系统可在体外实现异源半抗体之间的精确装配。该技术已经实现 1500 L 规模的产业化应用。相似的生产技术也可以应用于“杵臼”结构双功能抗体的生产。除了共用序列相同的轻链或进行体外装配,通过 Crossmab 技术也可促进抗体轻链的正确装配。代表产品是罗氏公司正在进行 I 期临床研究的 Ang-2/VEGF Crossmab 技术是在“杵臼”改造的基础上,CrossMab CH1-CL 。
将 Ang-2 抗体 Fab 结构域中的 CL 与 CH1 互换,而 VEGF 抗体的 Fab 结构则保持不变。经过改造的 Ang-2 抗体轻链不易与 VEGF 抗体的重链发生错配,同时“杵臼”结构可促进两条重链异源二聚化[6]。除“杵臼”结构之外,还可通过 IgG 和 IgA CH3 的链交换(strand-exchange engineered domain,SEED )技术实现不同半抗体的 Fc 配对[7]。
基因工程抗体技术的发展特别是噬菌体展示库技术的广泛应用,可对抗体结合表面进行重塑,从而赋予其结合 第二抗原的高亲和力,通过该技术所构建的双功能抗体称 为 DAF(dual action fab)。文献报道,通过对赫赛汀抗体(Herceptin )轻链的互补决定区(CDR )的氨基酸序列进行改造,在保持对 HER2 抗原结合能力的条件下,成功获得了对 VEGF 抗原的亲和力;经过进一步亲和力成熟后,DAF 抗体对抗原 HER2 和 VEGF 的亲和力分别达到 0.2 与其他双功能抗体利用不同的半抗体可变区和 3 nmol/L[8]。结合各自靶抗原不同,DAF 双功能抗体的双臂可变区序列相同但又可以同时结合两个抗原,因而完全保持了正常 IgG 抗体的结构,不降低其稳定性,而且可以应用常规抗体表达生产技术实现产业化,其在下游生产工艺、制剂开发和体内药代动力学等方面具有突出的优势。
[5]
胞受体 TCR-CD3 的结合,第二信号为 T 细胞与抗原提呈细胞表达的共刺激分子相互作用后产生的非抗原特异性共刺激信号。由于多数癌细胞表面的 MHC 的表达下调甚至缺失,从而逃逸免疫杀伤。CD3 × 双功能抗体则能够分别结合 T 细胞表面 CD3 分子和癌细胞表面抗原,从而拉近细胞毒性 T 细胞(cytotoxic T cell,Tc 或 CTL)与癌细胞的距离,引导 T 细胞直接杀伤癌细胞,而不再依赖于 T 细胞的双重激活信号。CD3 × 双功能抗体独特的 T 细胞激活方式被认为是其作用机制上的重大优势[2]。
目前与 CD3 抗体偶联的双功能抗体靶点有 10 余个,除已经上市的 CD3 × EpCAM 双功能抗体外,CD19、CD20、Her2、CEA 等靶点的双功能抗体品种也已进入临床研究。其中最受关注的是美国 Amgen 公司与德国 Micromet 公司联合开发的 BiTE 结构 CD3 × CD19 双功能抗体 blinatumomab [9]。该抗体正在进行 III 期临床研究,用于治疗急性前 B 淋巴细胞白血病(B-precursor ALL)。blinatumomab 通过介导 T 细胞特异性杀伤 CD19 阳性 B 淋巴癌细胞发挥作用,具有疗效好、剂量低的临床优势。美罗华抗体治疗淋巴癌的临床用量为 375 mg/(m2·w) ,4 周/疗程,而 blinatumomab 的临床剂量仅为 5 ~ 15 μg/(m2·d) ,每个疗程连续静脉注射 28 d。在参加 II 期临床实验的 25 名患者中,有 17 名患者(占 68%)在前两个疗程中取得了血液学完全缓解(complete remission,CR )或血液学部分缓解(CR with partial hematological recovery),微小残留病灶(minimal residual disease,MRD )水平小于 10-4。由于 BiTE 结构 CD3 × 双功能抗体的独特结构和作用机制,blinatumomab 在临床上的不足也很明显。除前述由于单链抗体半衰期短,临床上需要长期连续静脉注射之外,CD3 抗体与 T 细胞结合后引起细胞因子风暴,引起临床较高的副反应发生率。目前介导 T 细胞杀伤的双功能抗体在血液肿瘤方面显现出了优势,但其在实体瘤方面的疗效还有待临床进一步证明。运用 Triomab 技术开发的 CD3 × HER2 抗体 Ertumaxomab 可应用于治疗赫赛汀治疗后复发的乳腺癌,但在进入 II 期临床后即被停止开发。 2.2 双靶点阻断
双功能抗体的另一个重要的作用机制是同时结合双靶点,阻断双信号通路。该机制的应用范围更为广泛,包括肿瘤、自身免疫性疾病、抑制血管生长和抗感染等方面的治疗。以在细胞生理过程中发挥重要调节作用的跨膜酪氨酸激酶受体 HER 家族为例,该家族包括 HER1(erbB1、EGFR ),HER2(erbB2、NEU ),HER3(erbB3)及 HER4(erbB4)等成员,在很多上皮来源的实体瘤细胞表面异常高表达,是肿瘤靶向治疗的重要靶点。已经上市的抗体有结合 HER2 D4 结构域的赫赛汀单抗、结合 HER2 D2 结构域的帕妥珠单抗(Perjeta )以及结合 HER1/EGFR 的爱必妥单抗(Erbitux )等,广泛应用于乳腺癌、胃癌、结直肠癌等实体瘤的临床治疗。研究揭示,HER 家族成员自身或不同成员之间的同源或异源二聚体激活细胞内信号,促进细胞增殖、
2 双功能抗体的作用机制
2.1 介导 T 细胞杀伤
双功能抗体的一个重要机制是介导 T 细胞杀伤。近年来,随着对癌细胞免疫逃逸机制认识的深入和肿瘤免疫治疗(cancer immunotherapy)的兴起,激活 T 细胞的抗体药物研究备受重视。通常认为有效激活 T 细胞需要双重信号,第一信号来自抗原提呈细胞上 MHC-抗原复合物与 T 细
中国医药生物技术 2014年8月第9卷第4期 Chin Med Biotechnol, August 2014, Vol. 9, No. 4 293
肿瘤发展。赫赛汀抗体阻断 HER2 受体同源二聚,但不能阻断 HER2 与其他受体间的异源二聚。HER2 与 HER3 是 HER 家族激活初始致癌信号的最强二聚体形式,在临 床上将能够阻断该二聚化的帕妥珠单抗与赫赛汀联用,取 得了比单个抗体更好的疗效,揭示了双靶点阻断的临床效 果
[10]
参考文献
[1] Spasevska I. An outlook on bispecific antibodies: Methods of
production and therapeutic benefits. Biosci Master Rev, 2014, 1-7. [2] Baeuerle PA, Reinhardt C. Bispecific T-cell engaging antibodies for
cancer therapy. Cancer Res, 2009, 69(12):4941-4944.
[3] Wu C, Ying H, Grinnell C, et al. Simultaneous targeting of multiple
disease mediators by a dual-variable-domain immunoglobulin. Nat Biotechnol, 2007, 25(11):1290-1297.
[4] Carter P. Bispecific human IgG by design. J Immunol Methods, 2001,
248(1-2):7-15.
[5] Gramer MJ, van den Bremer ET, van Kampen MD, et al. Production
of stable bispecific IgG1 by controlled Fab-arm exchange: scalability from bench to large-scale manufacturing by application of standard approaches. MAbs, 2013, 5(6):962-973.
[6] Schaefer W, Regula JT, Bähner M, et al. Immunoglobulin domain
crossover as a generic approach for the production of bispecific IgG antibodies. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011, 108(27):11187-11192. [7] Davis JH, Aperlo C, Li Y, et al. SEEDbodies: fusion proteins based on
strand-exchange engineered domain (SEED) CH3 heterodimers in an Fc analogue platform for asymmetric binders or immunofusions and bispecific antibodies. Protein Eng Des Sel, 2010, 23(4):195-202. [8] Bostrom J, Yu SF, Kan D, et al. Variants of the antibody herceptin that
interact with HER2 and VEGF at the antigen binding site. Science, 2009, 323(5921):1610-1614.
[9] Chames P, Baty D. Bispecific antibodies for cancer therapy: the light
at the end of the tunnel? MAbs, 2009, 1(6):539-547.
[10] Kristjansdottir K, Dizon D. HER-dimerization inhibitors: evaluating
pertuzumab in women's cancers. Expert Opin Biol Ther, 2010, 10(2): 243-250.
[11] Labrijn AF, Meesters JI, de Goeij BE, et al. Efficient generation of
stable bispecific IgG1 by controlled Fab-arm exchange. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013, 110(13):5145-5150.
[12] Spiess C, Bevers J 3rd, Jackman J, et al. Development of a human
IgG4 bispecific antibody for dual targeting of interleukin-4 (IL-4) and interleukin-13 (IL-13) cytokines. J Biol Chem, 2013, 288(37):26583- 26593.
。
临床前研究显示,能够结合 HER2 抗原不同结合域的 FAE 结构 HER2 × HER2 双功能抗体抑瘤活性优于赫赛汀抗体[11]。能够同时结合 EGFR 与 HER3 的 DAF 型双功能抗体,同样显示出优于单一靶向 EGFR 抗体 Erbitux 的疗效。在自身免疫性疾病治疗领域,同时结合 IL-13 和 IL-4 双靶点的“杵臼”结构 IgG4 亚型双功能抗体也已经进入临床研究[12]。
3 结语与展望
双功能抗体的设计依赖于疾病发病分子机制、双功能抗体作用机制及其副作用机制的深入研究。该领域仍然有很多待解决的问题,如 CD3 × 双功能抗体结合 CD3 后如何避免引起细胞因子风暴、双靶点亲和力如何平衡等。
双功能抗体在双重阻断和诱导 T 细胞肿瘤杀伤的作用机制等方面具有无可替代的优势。随着上游基因工程技术和下游生产技术的发展,目前可以构建与常规全抗体分子结构一致或相似的双功能抗体,并实现规模化生产,为双功能抗体未来更广泛的应用铺平了道路;越来越多的双功能抗体进入临床研究。可以预见,双功能抗体药物在未来将会成为抗体药物发展的新增长点。
(上接第 302 页)
[12] Pilorge S, Rigaudeau S, Rabian F, et al. Fractionated gemtuzumab
ozogamicin and standard dose cytarabine produced prolonged second remissions in patients over the age of 55 years with acute myeloid leukemia in late first relapse. Am J Hematol, 2014, 89(4):399-403. [13] Siddiqi T, Thomas SH, Chen R. Role of brentuximab vedotin in the
treatment of relapsed or refractory Hodgkin lymphoma. Pharmgenomics Pers Med, 2014, 7:79-85.
[14] Chen X, Soma LA, Fromm JR. Targeted therapy for Hodgkin
lymphoma and systemic anaplastic large cell lymphoma: focus on brentuximab vedotin. Onco Targets Ther, 2013, 7:45-56.
[15] Burris HA 3rd, Rugo HS, Vukelja SJ, et al. Phase II study of the
antibody drug conjugate trastuzumab-DM1 for the treatment of human epidermal growth factor receptor 2 (HER2)-positive breast cancer after prior HER2-directed therapy. J Clin Oncol, 29(4):398-405.
[16] Krop IE, Beeram M, Modi S, et al. Phase I study of trastuzumab-DM1,
an HER2 antibody-drug conjugate, given every 3 weeks to patients with HER2-positive metastatic breast cancer. J Clin Oncol, 28(16): 2698-2704.
[17] Diéras V, Bachelot T. The success story of trastuzumab emtansine, a
targeted therapy in HER2-positive breast cancer. Target Oncol, 2014, 9(2):111-122.
[18] Sassoon I, Blanc V. Antibody-drug conjugate (ADC) clinical pipeline:
a review. Methods Mol Biol, 2013, 1045:1-27.
[19] Mullard A. Maturing antibody-drug conjugate pipeline hits 30. Nat
Rev Drug Discov, 2013, 12(5):329-332.
[20] Kovtun YV, Audette CA, Mayo MF, et al. Antibody-maytansinoid
conjugates designed to bypass multidrug resistance. Cancer Res, 2010, 70(6):2528-2537.