染色质免疫沉淀ChIP

染色质免疫沉淀（ChIP）实验指南及技术总结

ChIP是一项比较流行的研究转录因子（transcriptionfactor,TF）与启动子（promoter）相互结合的实验技术。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。

染色质免疫沉淀分析（ChiP）是基于体内分析发展起来的方法，它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并通过超声或酶处理将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过抗原抗体的特异性识别反应沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。它能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的一种很好的方法。CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且，CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。

一般ChIP的流程是：甲醛处理细胞---收集细胞，超声破碎---加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合---洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联，纯化富集的DNA-片断---PCR分析。

在PCR分析这一块，比较传统的做法是半定量-PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及，大家也越来越倾向于Q-PCR了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP（其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合，具体方法和ChIP差不多，只是实验过程中要注意防止RNase，最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA）；还有ChIP-chip（其实就是ChIP富集得到的DNA-片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基础上有所改变，不同的公司有不同的做法，要根据公司的要求来准备样品）。

第一天：

（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。

1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243 ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％（培养基共有9ml）。

2、37摄氏度孵育10min。

3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。450 ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。

4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。

5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。预冷后2000rpm

5min收集细胞。

6、倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80％。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起，共800ul。

7、超声破碎：VCX750，25％功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。

（二）、除杂及抗体哺育。

8、超声破碎结束后，10，000g 4oC离心10min。去除不溶物质。

留取300ul做实验，其余保存于-80oC。

300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul加入4ul5MNaCl（NaCl终浓度为0.2M），65oC处理3h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。

9、在100ul的超声破碎产物中，加入900ulChIPDilutionBuffer和20ul的50×PIC。 再各加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4oC颠转混匀1h。

10、1h后，在4oC静置10min沉淀，700rpm离心1min。

11、取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul抗体，另一管中则不加抗体。4oC颠转过夜。

（三）、检验超声破碎的效果。

取100ul超声破碎后产物，加入4ul5MNaCl，65oC处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。

第二天：

（一）、免疫复合物的沉淀及清洗。

12、孵育过夜后，每管中加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4oC颠转2h。 13、4oC静置10min后，700rpm离心1min。除去上清。

14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在4oC颠转10min，4oC静置10min沉淀，700rpm离心1min，除去上清。

洗涤溶液：a.low salt wash buffer-one wash

b.highsalt wash buffer-one wash

c.LiCl wash buffer-one wash

d.TE buffer-two wash

15、清洗完毕后，开始洗脱。洗脱液的配方：100ul10％SDS，100ul1MNaHCO3，800ulddH2O，共1ml。

每管加入250ul洗脱buffer，室温下颠转15min，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500ul。

16、解交联：每管中加入20ul 5M NaCl（NaCl终浓度为0.2M）。

混匀，65oC解交联过夜。

第三天：

（一）、DNA样品的回收

17、解交联结束后，每管加入1ulRNaseA（MBI），37oC孵育1h。

18、每管加入10ul0.5MEDTA，20ul1MTris.HCl（PH6.5），2ul10mg/ml蛋白酶K。 45oC处理2h。

19、DNA片段的回收----omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100ulddH2O。

（二）、PCR分析