基因工程复习V2.1

第一章 绪论 名词解释(镇鸿)

基因工程：通过基因操作，将目的基因或DNA 片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复

制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传性状

的操作。

基因操作：泛指对基因进行酶切、连接、转化等分子生物学操作，是基因工程的技术基础。

遗传工程：根据遗传学原理，按照人们预先设计的生物蓝图，对生物的遗传物质进行有计划的操作，以

达到定向改造生物的遗传组成，使其获得新的遗传性状，这个工程称为遗传工程。包括常规

的有性杂交育种，染色体工程，细胞工程以及基因工程等。

基因克隆：是指对基因进行分离和扩大繁殖等操作过程，其目的在于获得大量的基因拷贝，它在

技术上包括载体构建、大肠杆菌遗产转化改良。

1、 什么是基因工程？它包括哪些环节？

基因工程是通过基因操作，将目的基因或DNA 片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传性状的操作。

具有以下几个重要特征：（1）打破物种的界限，实现跨物种的基因转移；（2）通过已知功能基因的遗传转化，可进行物种的定向改良；（3）可以创造出自然界中原本没有的生物。

它包括以下环节：①目的基因克隆 ②载体的准备 ③目的基因与载体的连接 ④重组DNA 转转染/转导 ⑤重组体的筛选与鉴定 ⑥重组体的大量培养，外源基因表达效应分析与开发应用

2、 基因工程与基因操作、基因克隆、遗传工程等概念有什么异同？

基因操作泛指对基因进行酶切、连接、转化等分子生物学操作，是基因工程的技术基础。

基因克隆是指对基因进行分离和扩大繁殖等操作过程，其目的在于获得大量的基因拷贝，它在技术上主要包括载体构建、大肠杆菌遗传转化、重组子筛选和扩大繁殖等环节，很多时候并不涉及动物、植物等的转化及性状的遗传改良，显然与基因工程不完全一致。

遗传工程广义的是指所有能改变生物体遗传性状的技术，包括常规的有性杂交育种、染色体工程、细胞工程以及基因工程等。

3、 基因工程的基本条件有哪些？它们各自在基因工程中起着什么作用？

①目的基因: 是开展基因工程的目标和物质基础。

②载体: 是运载工具，引入的外源基因到宿主细胞中，使其进行复制或表达。

③工具酶: 指体外进行DNA 合成、切割、修饰和连接等系列过程中所需要的酶。

④受体细胞: 摄取外源目的DNA 并使其稳定维持和表达。

4、 基因工程的技术策略有哪些？

（1）强化基因的表达，通过增强目标性状对应基因的拷贝数，提高目的酶表达量与活性，实现目标性状的改良。

（2）关闭特定基因的表达，实现目标性状的改良。

（3）基因的异源表达赋予生物新的功能。

第二章：基因工程酶学基础

名词解释（仁杰）

限制性内切酶：能识别DNA 的特异序列，并在识别位点或其附近切割双链DNA 的一类内切核酸酶。

黏性末端：DNA 分子在限制性内切核酸酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸形成的末端结构。

平末端：限制性内切核酸酶在识别序列的对称轴上切割，形成的片段为平末端。

同切点酶：又称同裂酶，是一类来源于不同的微生物、能识别相同靶序列的限制性内切核酸酶。

同尾酶：来源不同，识别靶序列也不同，但切割后能产生相同的黏性末端的限制性内切核酸酶。

DNA 连接酶：能催化双链DNA 片段靠在一起的3' 羟基末端和5' 端磷酸基团末端之间通过形成磷酸二酯键，使两

末端连接的一种核酸酶。

DNA 聚合酶：在引物和模板存在下，把脱氧核糖单核苷酸连续的加到双链DNA 分子引物链的3'-OH 末端，催化

核苷酸的聚合作用的一类酶。

反转录酶：依赖于RNA 的DNA 聚合酶，普遍存在于含RNA 的反转录病毒中，以RNA 为模板，催化合成互补的DNA

单链，进而合成DNA 的第二条链。

末端脱氧核苷酸转移酶：简称末端转移酶（TDT ），一般从小牛胸腺中提取的一种碱性蛋白，在末端转移酶的催

化下将脱氧核苷酸添加到DNA 分子的3'-OH 末端，伴随无机磷酸的释放。

碱性磷酸酶：能够催化核酸分子脱掉5' 的磷酸基团，从而使DNA （或RNA ）片段的5'-P 末端转化成5'-OH 末端。 脱氧核糖核酸酶I ：简称DNA 酶I （DNase I），来源于牛胰脏的糖蛋白，需要二价阳离子的内切核酸酶，能从嘧

啶核酸5' 端磷酸基处随机降解单链或双链DNA ，生成具有5' 磷酸末端的寡核苷酸。（有Mg2+存在

时，DNase I能在双链DNA 上随机独立的产生切口，在Mn2+存在时，则在双链DNA 的大致同一位置

上切割，产生平末端DNA 片段。）

(力坤)

1. II型限制性内切核酸酶的基本特性有哪些？

II 型限制性内切核酸酶只有一种多肽，以同源二聚体的形式存在，其识别和切割DNA 分子具有严格的特异性。 ①识别序列的特异性：识别序列为4-6bp 的双重螺旋对称结构的回文序列

②切割位点的特异性：在识别序列内或附近特异切割双链DNA 分子，水解磷酸二酯键，产生3’端羟基、5’端磷酸基团的DNA 片段。

2. 大肠杆菌DNA 聚合酶I 有哪些不同的酶活力特性，各有何利用价值？

【

（1） 5' →3' 聚合酶活性

大肠杆菌DNA 聚合酶I 的聚合酶活性是以DNA 为模板，利用体系中的4种脱氧核糖核苷（dNTP ），催化单核苷酸分子加到引物的3' -OH末端，沿5' →3' 合成与模板互补的另一条DNA 链，模板DNA 可以是单链或双链DNA 分子，双链DNA 只有在其一条链上有一个或数个断裂时才可以作为有效模板。

（2） 3' →5' 外切酶活性

大肠杆菌DNA 聚合酶I 的 3' →5' 外切酶活性是沿3' →5' 方向识别和切除不配对的DNA 生长链末端的核苷酸，这种外切酶活性在体内DNA 复制时主要起校对作用。当DNA 复制中掺入的核苷酸与模板不互补而游离时就会被其3' →5' 外切酶切除，以便重新在这个位置上聚合对应的核苷酸。这种校对功能保证了DNA 复制的真实性，从而降低突变率。

（3） 5' → 3' 外切酶活性

大肠杆菌DNA 聚合酶I 的5' →3' 外切酶活性，是从5' 端降解双链DNA 分子。它也可以降解 DNA : RNA 杂合体中的RNA 分子，即具有RNA 酶H 的活性。这种酶外切活性特点是：待切除的核酸分子必须具有 5' 端游离磷酸基团；核苷酸分子被切除前位于已配对的DNA 双螺旋区段上；被切除的可以是脱氧核苷酸，也可以是非脱氧核苷酸。

】

3. Klenow 片段和大肠杆菌DNA 聚合酶I 有何异同？

【

（1）Klenow 片段是来自大肠杆菌DNA 聚合酶I 的大片段；

（2）DNA 聚合酶I 具有5’→3’聚合酶活性，3' →5' 核酸外切酶活性，5' →3' 核酸外切酶活性；

Klenow 片段只有5’→3’聚合酶活性，3' →5' 核酸外切酶活性。

】

4. 为什么说反转录酶是一种特殊的DNA 聚合酶（自己总结的），其主要用途是什么？

反转录酶是依赖于RNA 的DNA 聚合酶。它有合成DNA 的活性，只不过模板是RNA ，这与一般DNA 聚合酶不同。 主要用途：①以mRNA 为模板合成其互补DNA （cDNA ），用于构建cDNA 文库和基因克隆；②对具5’端突出的DNA 片段的3’端进行补平和标记，制备杂交探针；③代替大肠杆菌DNA 聚合酶I Klenow 片段或测序酶，用于DNA 序

列分析。

5. 【 几种不同的修饰性工具酶在基因工程中具有的重要用途。】

∙ 末端脱氧核苷酸转移酶

o 用于克隆DNA 片段：将同聚物尾巴添加到3’末端

o 用于DNA 片段3’末端标记。

o 按照模板合成多聚核糖核苷同聚物

∙ 多核苷酸激酶

o 标记DNA 或RNA 的5’末端。

o 在DNA 分子连接时，对缺乏5’磷酸基团的DNA 片段或人工合成接头进行磷酸化处理。

∙ 碱性磷酸酶

o DNA 分子片段5’末端的去磷酸化，防止自身连接。

o 在5’末端标记之前，去除DNA 或RNA 分子的5’末端磷酸基团。

第三章 载体

名词解释（旭华）：{红色部分为11.27添加整理}

1. 载体：能携带外源基因（或DNA 片段）进入细胞复制、整合或表达的工具就称为载体（vector ）.

2. 克隆载体：用于携带DNA 片段进入宿主细胞进行复制或保存的载体（目前主要有：质粒载体、噬菌体载体、

黏性载体、人工染色体等）。

3. 表达载体：表达载体是可携带DNA 片段进入宿主细胞进行复制并进行转录、翻译的载体。（一般在克隆载体的

基础上增加了基因表达的调控元件。）

4. 质粒载体：（P38-39页归纳）通过存在于多种宿主细胞、独立于染色体外的可自主复制闭合环状的质粒进行人

工改造（选择合适的复制起始位点、加入合适的选择标记基因、增加或减少酶切位点、缩短长度）而构

建的克隆载体。

5. 质粒的不相容性：两种质粒在同一宿主细胞中不能共存的现象称为质粒的不相容性（相反则称为相容性）。

6.RNAi ：双链RNA （double-strandsed RNA,dsRNA）对基因表达的阻断作用被称为RNA 干扰（RNA interference,RNAi） 7. 噬菌体载体：基因克隆另一类重要的载体是病毒载体。噬菌体主要有双链噬菌体和单链丝状噬菌体两大类。双链噬菌体为λ类噬菌体，单链丝状噬菌体有M13、f1、fd 噬菌体。 重组DNA 技术中常用的噬菌体克隆载体主要有λ类噬菌体和M13噬菌体。（来自百度百科，参照课本自行理解。）

8. 黏粒克隆载体：粘粒克隆载体由质粒和含有cos 位点的λDNA 片段所组成，大小一般在5~7Kb,包括质粒的复制起点、抗性标记基因、多克隆位点和λDNA 的cos 位点，既可以转化大肠杆菌并按质粒复制的方式进行复制，又可以承载 40Kb 左右的外源DNA 片段。由于黏粒载体带有噬菌体的包装序列，可以用包装蛋白包装，不带外源DNA 片段的载体因为包装下限而不能被包装，具有很强选择性。包装产物通过感染宿主菌高效地将重组DNA 导入宿主细胞。黏粒载体被用于构建基因组文库。

9. 人工染色体：染色体具有复制功能，利用染色体的复制元件来驱动外源DNA 片段复制的载体称为人工染色体载体（artificial chromosome vector），其装载外源DNA 的容量比质粒、噬菌体和噬菌体-质粒杂合载体等有很大的拓展，甚至可以跟染色体的大小相媲美。

10. 质粒表达载体：质粒表达载体是在以质粒为基本骨架的克隆载体的基础上，组装启动子、转录终止子和核糖体结合位点等表达原件而构成的。

11. 大片段表达载体：（找不到概念，详见课本例子P59：TAC （可转移人工载体）、MAC （哺乳动物人工染色））

12.VIGS:病毒诱导的沉默基因（virus induced gene silencing，VIGS ）是利用植物体内天然存在的免疫机制，将目的基因片段构建到病毒载体中并用病毒侵染寄主植物，目的基因片段作为病毒的一部分同病毒一起复制并扩散到整株植物，植物体的防御机制被病毒激活后，在识别病毒和目的基因的同时，将内源的目的基因mRNA 降解，从而达到基因沉默的目的。

简答：

2. 什么是克隆载体，克隆载体必须满足哪些基本条件？

克隆载体是用于携带DNA 片段进入宿主细胞进行复制或保存的载体。必须满足如下基本条件：①具有对受体细胞的可转移性，能携带外源基因进入宿主细胞；②能在宿主细胞中自主复制，并实现外源基因的增殖；③具有由单一限制性内切核酸酶识别位点组成的多克隆位点（MCS ），可供外源基因的插入；④具有合适的选择性标记，用于含有重组质粒的宿主细胞筛选。

3．质粒具有哪些特性？

①复制：质粒DNA 携带有自己的复制起始区（ori ）以及与此相关的顺式作用元件，它们使质粒独立于宿主细胞的染色体自主复制并保持其固有的遗传信息及相对稳定的拷贝数。不同质粒在宿主细胞内的拷贝数可以是不同的，根据其数量可将质粒复制方式分为严谨型（1至数个）和松散型（10个以上）；

②质粒的不相容性：在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒一般不能够在同一宿主细胞中稳定共存；

③质粒的转移性： 含有tra 基因的质粒会促使宿主细胞与受体细胞接合，使质粒从一个细胞转移到另一个细胞中；不含tra 基因的质粒则不具备转移性（即非接合型质粒，分子质量小、拷贝数多、不会自动转移，比较安全）。

第四章（张奇）

名词解释：

琼脂糖凝胶电泳；用琼脂糖作支持物，在适当的条件下对带电生物大分子进行电泳的技术，主要

用于DNA 分子的分离、纯化和鉴定。

聚丙烯酰胺凝胶电泳；聚丙烯酰胶凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的垂直板凝胶电泳，

可根据电泳样品的电荷、分子大小及形状的差别分离物质。聚丙烯酰胺凝胶既具有分

子筛效应，又具有静电效应，其分辨力高于琼脂糖凝胶电泳，适用于低分子 DNA (1-1000

bp) 、寡聚核苷酸和白质的分离，可分离只相差一个核苷酸的不同 DNA 片段，是DNA

序列分析中的关键技术之一。

Southern 杂交：是将DNA 片段从琼脂糖转移到滤膜上。检测特点DNA

Northern 杂交：检测某一特定RNA 分子的方法，可用于RNA 定性和定量分析。

Western 杂交：检测结果可知被检生物细胞内目的蛋白的表达与否，表达量及分子质量等情况。 脉冲电泳；是一种交替变换电场方向的电泳，以一定的角度并以一定的时间变换电场的方向，使

DNA 在微观上按“Z ”字形向前泳动，从而达到分离相对分子量大的DNA 片段的目的，

可区分长度为50kb 或100kb 以上，甚至Mb 级的大片段DNA 。。

探针：是指用于检测特定基因或转录产物存在或表达DNA 、RNA 或寡聚核苷酸序列，这些序列在使

用之前，需要进行标记。

切口平移法标记：先DNA 酶I 随机在探针DNA 上打开缺口，然后利用DNA 聚合酶I 5’→3’外切

酶活性，在缺口处按5’→3’方向切除单核苷酸；同时DNA 聚合酶I 有5’→3’的聚

合酶活性，在缺口处3’端加入底物中的单核苷酸，弥补缺口处的核苷酸链。随着反应

的进行底物中被标记单核苷酸，并被随机掺入。DNA 聚合酶I 的两种作用交替进行，探

针即被标记。

随机引物标记法；利用由6个核苷酸组成的序列随机的寡核苷酸为引物，在Klenow 酶的作用下对

标记的DNA 进行随机扩增。

菌落(或噬菌斑) 杂交:是将标记的核酸(抗体）探针与固定在细胞或组织中的核酸(抗原）进行杂交，

所以也称为原位杂交。

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)简称PCR ，是以DNA 为模板，利用DNA 聚合酶活性

体外扩增特定的基因片断，这种方法被称为DNA 聚合酶链式反应。

引物：是指在PCR 反应中与待扩增的靶DNA 区段两翼互补的寡聚核苷酸，其本质是单链DNA 片段。 反转录PCR ：扩增mRNA 的一种实验技术。先将mRNA 反转录成cDNA ，然后再以cDNA 为模板，用PCR

方法加以扩增。

锚定PCR: 用于扩增已知一端序列的目的DNA 。在未知序列一端加上一段多聚dG 的尾巴，然后

分别用多聚dC 和已知的序列作为引物进行PCR 扩增。

反向PCR （inverse PCR ）:是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA 片段对某个已知DNA 片段

两侧的未知序列进行扩增.

巢式PCR:采用两对引物进行PCR ，其中第二对引物位于第一对引物内. 【回答不够，还要回到课本

中】

实时定量PCR :在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后

通过标准曲线对模板中特定基因进行定量分析的方法。

双脱氧链终止法测序：核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录

时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺

入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反

应体系中便合成以共同引物为5’端，以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的

核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段(长度

相邻者仅差一个碱基) ，根据片段3’端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。

（文斌）（问老师）凝胶阻滞试验，又叫DNA 迁移率变动试验。在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的

DNA 朝正电极移动的距离与其分子质量的对数成反比。如果DNA 分子结合上一种蛋白质，由于

分子质量加大，在凝胶中的迁移子作用便会受到阻滞，朝正电极移动速度变慢，移动的距离相应

缩短。所以，当特定的DNA 片段同细胞提取物混合之后，若它在凝胶电泳中的移动距离变短了，

说明它已同提取物中的某种特殊蛋白质分子发生了结合。

（问老师）DNase I足迹试验是一种鉴别RNA 聚合酶等蛋白质在DNA 上结合位点的方法，它不仅能找到与特

异性DNA 结合的目标蛋白，而且能告知目标蛋白结合在哪些碱基部位。足迹试验的方法较多，

常用的有DNase I足迹试验和硫酸二甲酯足迹试验(dimethylsulfate，DMS) ，两者原理基本相同。

（问老师）甲基化干扰试验(删除) 通过对核苷酸进行甲基化修饰，检验DNA 链中哪些区域与特定蛋白质结合的试验方法。

4、如何检测、评价提取的DNA 、RNA 的【质量】？

⑴核酸、蛋白、多糖等在紫外光区吸收峰各不相同，蛋白质的最大吸收峰在280nm 处，多糖的最大吸收峰在230nm 处，而核酸的最大吸收峰在260nm 处，据此可以通过紫外光光度法测定OD260/OD230与OD260/OD280即A260/230与A260/280检测所提取核酸的污染程度；

⑵琼脂糖凝胶电泳鉴定 采用凝胶电泳也可以粗略鉴定DNA 或RNA 的是否发生降解或污染。

5. 如何确定提取的DNA 、RNA 的浓度

紫外分光光度法

（1）. 原理基于DNA(或RNA) 分子在260nmm 处有特异的紫外吸收峰且吸收强度与系统中DNA

或RNA 的浓度成正比。分子形状、双链与单链之间的转换也会导致吸收水平的改变，但是这种偏差可以用特定的公式来校正。该法的特点是准确、简便，但所需仪器较昂贵。

（2）. 在波长260nm 紫外光下，1 OD 值的吸光度相当于双链DNA 浓度为50μg/ml；单链DNA 为37 μg/ml；RNA 为40 ug/ml。（第二点自己选择记忆。）

6. （老师给的）琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳和脉冲电泳的原理是什么？各有什么用途? 影响因素有哪些？

原理：核酸分子中磷酸基团一般呈离子化状态， DNA和RNA 的多核苷酸链实际上是多聚阴离子（polyanions ），它们在电场中可向着正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA 或RNA 分子的迁移速度取决于核酸分子大小和构型。分子量小比分子量大的分子迁移【快】，紧密构型分子比同分子量的松散型开环分子或线性分子迁移快，据此，可分离不同大小的DNA 或RNA 分子。

琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖为支持物，在适当的条件下对带电生物大分子进行电泳的技术，主要用于DNA 分子的分离、纯化和鉴定。

聚丙烯酰胶凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的垂直板凝胶电泳，可根据电泳样品的电荷、分子大小及形状的差别分离物质。聚丙烯酰胺凝胶既具有分子筛效应，又具有静电效应，其分辨力高于琼脂糖凝胶电泳，适用于低分子 DNA (1-1000 bp)、寡聚核苷酸和白质的分离，可分离只相差一个核苷酸的不同 DNA 片段

是一种交替变换电场方向的电泳，以一定的角度并以一定的时间变换电场的方向，使DNA 在微观上按“Z ”字形向前泳动，从而达到分离相对分子量大的DNA 片段的目的，可区分长度为50kb 或100kb 以上，甚至Mb 级的大片段DNA 。

凝胶电泳中影响DNA 分子泳动的因素很多，主要有DNA 分子特性和电泳条件两个方面

（文斌）7. 核酸分子杂交的原理是什么？【 Southern 杂交、Northem 杂交、Western 杂交的基本原理及其应用(重新认真再整理) 】

核酸分子杂交的原理：具有互补的特定核苷酸单链DNA 或RNA 混在一起时，其相应同源区段将会退火形成双链结构。

把一段已知基因（DNA 或RNA ）的核酸序列用合适的标记物（如放射性同位素、生物素等）予以标记，当作探针（probe),

与变性后的单链基因组DNA 或RNA 等进行杂交，再用合适方法（如放射自显影或免疫组织化学等技术） 把标记物检

测出来，就可确定靶核苷酸序列的存在情况。核酸杂交技术应用于重组子鉴别、基因分离、DNA 片段分析、基因表达

研究等

8.PCR 的反应步骤有哪些？PCR 反应体系含有哪些基本成分？

步骤：

◆ 变性（denatureation ）：92-96℃的高温处理可使模板DNA 双链间氢键断裂，解离成单链但不改变其化学性质，变性的时

间一般为30秒, 如果模板的G+C含量较高，变性时间可适当延长。变性后的单链DNA 游离于反应体系中作为模板;

◆ 退火（annealing ）：体系温度降至合适温度，使加入的引物与模板DNA 碱基序列互补结合。退火的温度取决于引物的Tm

值;

◆ 延伸（extension ）：在72℃温度下，DNA 聚合酶将dNTP 连续加到引物的3’-OH 端，以互补的DNA 单链为模板，沿着模板

延伸合成模板DNA 的互补链，称为延伸。一般每1min/kb来保证充足的延伸时间。

反应体系：

1. 缓冲液 2. MgCl2 3. dNTPs 4. 模板DNA (Template) 5. Taq DNA 聚合酶 6. 引物 (Primer-P)

第五章（林亿）

RACE ：cDNA 末端的快速扩增也是一种根据已知部分cDNA 序列扩增未知序列的PCR 技术。

简并序列：由于一个氨基酸可对应一个到多个密码子，因此一段氨基酸序列可以有多个可能的编码序列，称之位

简并序列。

基因组文库：是将某一生物基因组DNA 片段化并全部克隆后所获得的重组子群体的总称。

cDNA ：cDNA 文库是将生物特定的组织器官或特定发育时期的全部mRNA 反转录成cDNA ，并全部克隆成重组子。

在该重组子群体中包含了其全部表达基因的转录体。

DD-PCR ：是基于PCR 的mRNA 差异显示技术。是利用真核生物成熟mRNA 的3’polyA 结构，用oligo （dTMN ）（M=A、

C 、G ，N=A、G 、C 、T ）作为锚定引物与mRNA 的polyA 结合，在反转录酶的作用下将mRNA 反转录为

cDNA ，再以原oligo （dTMN ）和10bp 随机引物组成的引物对在不同来源的cDNA 中进行PCR 扩增，相

同引物对在不同来源cDNA 中的PCR 产物并排在聚丙烯酰胺测序胶上电泳分离。扩增的cDNA 片段通过

放射自显影或显色，即可获得差异表达基因的扩增条带。

（建松）如果已知某一蛋白的氨基酸序列，请设计几种方法分离该蛋白质基因的cDNA

答：设计简并引物、RACE （具体参考P101-P104，P122及其他第五章内容，这个需要自己总结，每个人都不一样。）

【（诗鹏）】7. 什么是简并引物？设计简并引物时怎样降低简并度？

简并引物：相应合成这一段简并序列PCR 扩增体系的引物叫做简并引物。

简并度与选取氨基酸序列的长度和这一序列氨基酸对应密码子的多寡相关。

可见简并度高的引物扩增假阳性率也会增加。因此在选取氨基酸序列时往往优先选取对应密码子较少的残基，如含甲硫氨酸和色氨酸残基的区域。选取氨基酸的长度一般为5个，对应一段15个的核苷酸序列。而且为了降低简并度，放弃最后一个氨基酸放弃其他密码子的第三位碱基，因此合成14个碱基的简并产物。

8．基因文库需要满足什么条件？有哪些类型的基因文库？

1．首先要满足文库的完整性，即文库应包含基因组的完整序列信息。2. 其次是要考虑基因组信息的可重建性。3. 第三个考虑因素是文库的大小，即文库中应包含的独立重组子数目。理想的基因文库还应具备以下条件。

1. 重组克隆的总数不宜过大, 以减轻筛选工作的压力。

2. 载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分割克隆。

3. 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆序列。

4. 克隆片段易于从载体分子上完整卸下。

5. 重组克隆能稳定保存，扩增，筛选。

基因文库的类型：

按外源DNA 骗的来源分基因文库为：基因组DNA 基因文库和cDNA 文库

根据所选用的载体可分为：质粒文库，噬菌体文库，粘粒文库，人工染色体文库，细菌人工染色体文库，酵母人工染色体文库。

9.cDNA 文库必须满足什么条件，其构造包括哪些步骤？

应满足的条件：文库的代表性和重组cDNA 的序列完整性。

第一方面为文库的代表性。cDNA 文库的代表性是指文库中包含的重组cDNA 分子反应来源细胞中表达信息（mRNA 种类）的完整性，它是体现文库质量的最重要指标。文库的代表性好坏可用文库的库容量来衡量，它是指构造的原始cDNA 文库所包含的独立的重组子克隆数。第二方面是重组cDNA 片段的序列完整性。要求文库中重组cDNA 具有分子的完整性。

cDNA 基因文库构建步骤

1. 细胞总RNA 的提取和mRNA 的分离

2. 第一条cDNA 合成

3. 第二条cDNA 合成

4. 双链cDNA 克隆进入质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。

（武福、仁杰）第六章

一、 名词解释

1、 DNA 体外重组：DNA 的体外重组是将目的基因通过重组到合适的载体上，这种重新组合的DNA 称为重

组DNA 。

2、 同聚物加尾法：利用末端转移酶可催化dNTP 加到单链或双链DNA3’-OH 末端的能力，在载体分子和外

源双链DNA3’-OH 末端加上互补同聚物尾巴，两者再通过同聚尾之间的互补形成可转化大肠杆菌的重组DNA 分子。

3、 衔接物：衔接物是指人工合成的一段由10~12nt组成、具有一个或数个限制性内切核酸酶识别位点的平

末端的双链寡核苷酸短片段。

4、 感受态细胞：处于能吸收外源DNA 分子的生理状态的细胞。

二、 问答题

1、外源DNA 片段与载体DNA 的重组主要有哪几种方法？各有何优缺点？

主要是依赖于核酸内切限制酶和DNA 连接酶的作用。

1) 黏性末端的连接法

A. 同一种酶产生的黏性末端的连接

当载体和外源DNA 用同一种限制性内切核酸酶消化时，可产生相同的黏性末端。当带有相同黏

性末端的DNA 片段一起退火，在DNA 连接酶的催化作用下黏性末端的单链之间便可进行碱基配对，

被共价地连接起来形成重组DNA 分子。

缺点：产生的目的基因会自身环化。

B. 不同种酶产生的黏性末端的连接

用两种限制性内切核酸酶消化载体DNA 和外源DNA 片段，使载体和外源目的基因的两端分别形

成不同的黏性末端，将它们混合，在连接酶的作用下相同的黏性末端可以退火连接成重组DNA 分子，

实现DNA 的定向连接。

优点：避免了载体和外源DNA 片段的自身连接，外源DNA 只能定向的连接到载体的相应位点之

间。

缺点：但也不可避免的会发生载体的位点黏性末端之间两个碱基互补形成开环。

还可应用同尾酶产生的黏性末端进行连接，这样可以避免载体自连并得到最高的连接。

2) 平末端的连接

优点：给不同的DNA 分子的连接带来极大的方便。

缺点：连接效率低，限制性内切核酸酶原有识别系列可能被破坏，外源DNA 的插入没方向性，可能产

生多拷贝插入现象。

A. 同聚物加尾法：优点：既可使两个平末端的DNA 片段进行连接，也可以使平末端的DNA 片段与黏性末端DNA

片段连接，连接效率较高

缺点：操作繁琐，外源片段难以收回，同聚物尾巴可能会影响外源基因表达。不能把插入片段再切下来

B. 衔接物连接法：适用于没有衔接物限制性内切核酸酶酶切位点的外源DNA 片段。

优点：是即有效又实用的手段，兼具同聚物加尾法和黏性末端连接法的优点，可以使任意两个不同末端的DNA 片段都能连接起来，增加衔接物浓度还可显著提高效率。

缺点：如果待克隆的DNA 片段或基因的内部含有与衔接物相同的限制性内切核酸酶识别位点，这样在酶切消化衔接物产生黏性末端的同时，也会把外源基因切成不同的片段，给后续的亚克隆及其他操作造成麻烦。

C. 接头分子连接法：

优点：能较好的克服衔接物连接法的缺点

缺点：接头之间会连接。

3) PCR 产物的连接

A. 引入酶切位点连接法

优点：效率较高，可有效地定向克隆PCR 产物

缺点：必须保证所选酶切位点在扩增的PCR 产物内部不存在，还需在5-端多合成3-4个碱基一利于稳定结合。

B. T-A 克隆法：优点：效率比平末端的连接至少高出100倍，可有效的直接克隆PCR 产物。

4) Gateway 载体构建系统：其是一个高效的大规模克隆系统。

优点：可以在不进行酶切和连接的基础上实现基因快速克隆及载体间平行转移，同时还有利于保持正确的开放阅读框和插入方向。可以使用并表达来自多种类型的DNA 序列。很适应于将大量的DNA 序列转移到各种不同的表达载体上。可通过添加Gateway 盒轻易地将直接感兴趣的载体改造成Gateway 目的载体。

缺点：DNA 重组序列位点具有毒性。

2、如何防止线状DNA 分子的自身环化

提高连接反应体系中目的基因对载体的比例，或用碱性磷酸酶对载体进行脱磷酸处理，去除DNA 片段的5’-末端的磷酸基。

3、如何将一平末端的DNA 片段与BamH I 形成的黏性末端连接？

将平末端的DNA 也用BamH I酶切，获得带有BamH I黏性末端的DNA ，将二者混合，在DNA 连接酶的作用下，它们的黏性末端互补，彼此退火连接形成环状的重组质粒。

【在平末端不存在酶切位点的情况下，则要在末端添加衔接物或含BamHI 酶切位点的接头，然后再进行酶切连接。】

4、举例说明两种植物转基因的方法。

①基因枪介导转化法

利用火药爆炸或高压气体加速，将包裹了带目的基因的DNA 溶液的高速微弹直接送入完整的植物组织和细胞中，然后通过细脑和组织培养技术，再生出植株，选出其中转基因阳性植株即为转基因植株。

②花粉管通道法

在授粉后向于房注射含目的基因的DNA 溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA 导入受精卵细胞，进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。

5、为什么pUC 系列的载体与外源基因形成的重组体可用蓝白斑实验进行筛选？

pUC系列载体是在pBR322质粒载体的基础上，组入了一个在其5′-端带有一段多克隆位点的lacZ ′基因。 pUC 系列载体的多克隆位点区处于β-半乳糖苷酶的α肽编码区内，插入外源DNA 片段后，α肽编码区错位，α肽失活，在将连接载体转入宿主细胞后，加入IPTG 诱导和X-gal 后，插入外源基因的载体菌落失去产生颜色的功能而呈白色，而没插入的菌落呈现蓝色，可以很方便的通过辨识菌落的颜色筛选到阳性克隆

6、某一质粒载体有tetr 和ampr 的表型，在ampr 中有一EcoRI 的酶切位点，现用EcoRI 切割载体进行基因重组，问如何用抗性变化筛选含有插入片断的重组体？

答：因ampr 上识别位点被EcoRI 切割，故该质体将失去抗Amp 的表型。将酶切后的质粒组装成的重组体转化菌先涂布在含有四环素的平板上生长，再将存活的菌落原位影印到另一个含有氨苄青霉素的平板上。在四环素平板上生长而在氨苄青霉素平板上不生长的菌落，即表明已筛选到含有插入片段的重组提质粒。

（940）第七章

1名词解释

启动子：是RNA 聚合酶识别、结合并起始转录的一段DNA 序列，其长度随生物种类不同而异。

增强子：是远距离调节启动子并提高转录效率的一段DNA 序列，由多个元件组成，每个元件可与一种或多种转录调控因子结合。

沉默子：是远距离调节启动子以降低转录效率的一段DNA 序列，是调节基因表达的顺式作用负调控元件。 终止子：是为转录提供终止信号的一段DNA 序列，是基因表达的顺式作用负调控元件。

衰减子：是原核生物基因表达调控的精细调节装置，是基因表达的顺式作用负调控元件。

2、影响外源基因在受体细胞中表达的因素主要有哪些？它们是怎样影响外源基因表达的？

答：①阅读框架对转化基因表达的影响：阅读框架是基因的编码区，包含从启始密码子至终止密码子之间的cDNA 序列。外源基因的编码区只有与表达载体DNA 的起始密码相吻合时，才能正确的转译出蛋白质。用人工接头可以调节阅读框架，选择合适的人工接头，即可将外源基因插入到表达载体的正确阅读框架中。

②顺式作用元件对基因表达的影响：是在转录水平上对基因表达有调节活性的DNA 序列，包括启动子，增强子，沉默子和衰减子。启动子能识别、结合并起始转录，增强子能远距离调节启动子并提高转录效率，沉默子与增强子相反，而衰减子能进行微调。

③翻译过程对表达的影响：翻译起始区有无二级结构影响结构基因的有效翻译，密码子的偏爱性也影响基因的表达，终止密码子能影响翻译的效率。

④表达系统对表达产物的影响; 受体细胞的生长特性、表达水平、翻译后修饰及生物活性会影响表达产物。

3、启动子和增强子有哪些异同点

1. 启动子：①序列特异性；②方向性 顺式调控元件；③位置特性 转录区上游；④种属特异性

2. 增强子：①双向性②重复序列③无位置特异④无基因特异⑤可增强转录⑥有组织特异

4. 能影响染色体上DNA 结构的三种顺式作用元件是什么？

【核基质结合区、绝缘子、基因座控制区】

5、什么是密码子的偏爱性？在外源基因的表达中有什么应用？

答：（1）尽管密码子在生物界是通用的，但不同的基因组对编码同一氨基酸的同义密码子的使用往往具有偏好性，有的同义密码子在一个基因组中使用频率高，而在另一个基因组中的使用频率低。通常，在基因组中使用频率高的同义密码子称为主密码子或偏爱密码子。

（2）因为外源基因mRNA 中的主密码子与受体细胞基因组的主密码子相同或相近，则该外源基因的翻译效率就高，因此，可以在不改变其编码多肽链一级结构的前提下，对外源基因的密码子进行相应的改造，使其含有受体细胞的主密码子，从而提高外源基因的表达效率。

6、原核生物基因表达调控的特点是什么？

①原核生物基因表达一般以操纵子为单位②原核生物只有一种RNA 聚合酶③原核生物无核膜，转录和翻译过程是偶联的④原核生物基因一般不含内含子，在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统⑤原核生物基因表达的调控主要在转录水平，这种控制比对基因产物的直接控制要慢。

8、大肠杆菌表达载体的必需结构元件有哪些？各个结构元件的作用是什么？

① 启动子：启动子是RNA 聚合酶识别、结合并起始转录的一段DNA 序列。

② 核糖体结合位点（RBS 又称为SD 序列）：在翻译起始阶段与核糖体小亚基16S rRNA 的3’端相互作用，以正确定位起始密码子。

③ 终止子：是表达载体必不可少的元件，既可避免高水平转录对高拷贝质粒稳定性的影响，又可使得转录出的mRNA 尽可能短，以提高mRNA 的稳定性，从而提高蛋白质的表达水平。

④ 选择标记基因：为了方便地从大量菌落中将转化的细胞分离出来，必须在构建表达载体时加上选择标记，使得转化体产生新的表型。

⑤ 复制子：包含复制起始位点和反式因子作用区在内的DNA 区段，含有复制需要的控制元件。

9、提高外源基因在原核生物细胞中表达的策略有哪些？【（太过简略了，要展开）】

答：转录水平、翻译水平的优化、提高目的产物的稳定性、质粒的拷贝数、宿主

菌的选择、培养条件的优化

10、按功能和作用方式，启动子可分为几种类型，每一种类型的启动子各有什么特点？

①组成型启动子：在所有组织中都能持续启动基因的表达，表达产物量相对恒定。

②组织特异性启动子：一般只发生在某些特定器官中，并往往表现出发育调节的特性。

③诱导型启动子：在某些特定的物理、化学或生物刺激下，可以大幅度提高基因的转录水平。 ④杂合启动子：构建杂合启动子是获得新启动子的一个重要途径。

12、真核生物表达载体通常需要哪些结构元件？【各个元件的作用是什么？】

② 增强子

③ 终止子

④ 内含子

⑤ polyA 加尾信号

⑥ 选择标记基因和报告基因

13、提高外源基因在真核细胞中表达的策略有哪些？【（太过简略了，要展开）】

转录水平的优化、翻译水平的优化、防止外源基因的失活、多基因策略

（940）第九章

4．植物、动物、微生物作为生物反应器生产基因工程药物各有哪些特点？

植物生物反应器

优点：①比较廉价；②可以对真核蛋白进行正确的翻译后加工；③合成外源蛋白相对比较安全；④转基因操作和克隆技术成熟。

缺点：①外源蛋白表达水平低；②重组蛋白中糖链结构改变；③下游生产成本高；④有安全性问题 动物生物反应器

优点：①生产的产品生化特性、活性和功能与天然蛋白相同，安全可靠；②生产药用蛋白表达量高；③生产成本较低；④生产简单，产品成本低，研制开发周期短，无污染。

缺点：①生产周期长；②基因整合率不高；③转基因动物死亡率较高且不能续代。

微生物生物反应器

特点：是基因工程药物最好的生物反应器。①可以高效表达外源基因；②可连续培养，易于产业化生产药用蛋白和抗生素。

（940）第十章

1．基因漂移：指转基因生物中的目标基因，在生物的个体、种群甚至是物种间自发移动的过程。

2．生物多样性：指地球上动物、植物、微生物等所有生物、它们所包含的基因以及由这些生物与环境相互作用所构成的生态系统的多样化程度。

3．生物安全：指转基因技术及遗传修饰体对动植物、人类健康及遗传资源和环境造成不利影响甚至危害的安全问题。

4. 转基因生物安全评价：对农业转基因生物实施安全评价是安全管理的核心和基础，它包括生态安全性评价和食品安全性评价两个部分。

5．实质等同性原则：是安全评价的起点，是指以有安全食用历史的传统食品为基础，要求转基因食品和它所替代的传统食品至少要同样安全。

6. 个案分析原则：个案分析原则主要针对不同基因、不同转化事件、不同环境条件的个案分析。

2．转基因生物潜在的安全隐患有哪些？请举例说明。

对人类健康的隐患：①潜在的致敏性；②非预期效应；③转基因食品基因水平转移对健康的影响；④转基因食品中重组DNA 对健康的影响；⑤食品营养成分改变对人群营养的影响。

对生态系统的隐患：①对生物遗传多样性可能有影响；②对物种多样性可能有影响；③对生态系统多样性可能有影响。

对农业的隐患：①有基因漂移的风险；②有杂草化问题；③对病虫害发生可能有影响。

问题。

对动物权益的隐患：

3. 基因工程对人类道德伦理的冲击表现在哪些方面？

基因工程的伦理道德问题主要表现在基因科研及信息管理的伦理问题、基因治疗的伦理问题以及克隆人的伦理问题三个方面。

4. 什么是生物安全管理？目前有哪些管理模式，各有什么特点？ 转基因技术及遗传修饰体会对动植物、人类健康及遗传资源和环境造成不利影响甚至危害，为了预防和控制这些不利影响采取的一系列措施就是生物安全管理。

① 宽松型的管理模式：以美国和加拿大为代表，其管理原则是转基因生物及其产品与非转基因生物及其产品没有本质的区别。

② 严厉性的管理模式：以欧盟国家为代表，其管理原则是首先假定转基因生物及其产品有潜在的危险，所有与其有关的活动都要进行严格的管理，并针对基因工程技术制定新的法规。 ③ 中庸型的管理模式：除上述国家外，世界上大多数国家的管理法则和条例处于正在逐步建立的过程中，既不宽松也不严厉。 5. 简述中国《农业生物基因工程安全管理实施办法》的适用范围？

① 适用的生物种类。《实施办法》适用的生物种类是农业生物，也就是中国农业部管辖范围内与农业有关的植物、动物、微生物和水生生物等。国家林业局所管辖的林业、野生动物和卫生部、国家医药局所管辖的药用植物、微生物等不属于这一范围。

② 适用的技术类型。《实施办法》适用的技术类型是基因工程，即仅限于利用载体系统的重组DNA 技术，以及利用物理、化学和生物等方法把重组DNA 导入有机体的技术。不包含细胞融合、染色体倍性操作和常规杂交技术等其他遗传操作技术。

③ 适用的阶段。《实施办法》对农业生物基因工程工作的全过程实行管理，包括试验阶段、中间阶段、环境释放和商品化生产各个阶段。

④ 适用的地域。《实施办法》适用的地域涵盖中国境内进行的所有农业生物基因工程植株，包括外国研制的农业生物遗传工程体及其产品拟在中国境内试验研究、中间试验、环境释放和商品化生产。