DNA的提取
《选修一》 DNA技术
考纲要求 1、DNA 的粗提取与鉴定。
2、PCR 技术。
课前准备(回归教材,基础知识点)
一、DNA 的粗提取与鉴定
1.提取原理:(1)利用DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度的__________中溶解度不同进行分离。
在2 mol/L的该溶液中________溶解而________析出,在0.14 mol/L溶液中________溶解而________析出。(2)DNA不溶于酒精,而________等杂质分子溶于酒精。
2.鉴定原理:在沸水浴条件下,DNA 遇_________试剂会被染成__________。
二、多聚酶链式反应扩增DNA 片段
1.PCR 技术的原理:利用了__________原理。通过控制__________来控制DNA 双链的解聚和结合。
2.PCR 反应的条件:一定的__________,DNA 模板,分别与两条模板链相结合的两种___________,四种___________,耐热的__________,同时控制_________使DNA 复制在体外反复进行。
想一想 细胞内DNA 复制与细胞外DNA 复制必需的酶是什么酶? 。
课堂探究(能力提升)
一、DNA 的粗提取与鉴定
1、简述DNA 的粗提取与鉴定原理。
2、完成该实验的实验步骤与鉴定图表:
(1)步骤:提取血细胞核物质(______涨破)→溶解(2 mol/L的NaCl)→过滤(除杂质)→析出(滴蒸馏水,降NaCl 浓度至______ mol/L)→过滤→再溶解(______ mol/L的NaCl)→过滤→进一步提纯(体积分数为________的冷却酒精)→鉴定。
1.本实验用鸡血细胞作实验材料,不能用哺乳动物的成熟红细胞,原因是哺乳动物的成熟红细胞内无细胞核,但它可以作为血红蛋白提取和制备细胞膜的理想材料。
2.实验过程中两次用到蒸馏水,第一次目的是使成熟的鸡血细胞涨破释放出DNA ,第二次目的是稀释NaCl 溶液,使DNA 从溶液中析出。
3.预冷的酒精溶液具有以下优点:(1)抑制核酸水解酶活性,防止DNA 被降解。(2)降低分子运动;易于形成沉淀析出。(3)低温有利于增加DNA 分子柔韧性,减少断裂。
典型考题
考情分析:考实验材料、实验原理、实验步骤,或者在实验题选项中出现辨析,多以选择题形式出现。
1. (2011·江苏卷,19) 在利用鸡血进行“DNA的粗提取与鉴定”的实验中,相关叙述正确的是( )
A .用蒸馏水将NaCl 溶液浓度调至0.14 mol/L,滤去析出物
B .调节NaCl 溶液浓度或加入木瓜蛋白酶,都可以去除部分杂质
C .将丝状物溶解在2 mol/LNaCl溶液中,加入二苯胺试剂即呈蓝色
D .用菜花替代允鸡血作为实验材料,其实验操作步骤相同
【答案】B
2. (2014 江苏卷)下列关于“DNA 的粗提取与鉴定”实验叙述,错误的是
A. 酵母和菜花均可作为提取DNA 的材料
B.DNA 既溶于2mol/LNaCl 溶液也溶于蒸馏水[来源:学&科&网]
C. 向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌,可见玻棒上有白色絮状物
D.DNA 溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热,冷却后变蓝
【答案】C
【解析】原则上含DNA 的生物材料都行,只是DNA 含量高的成功的可能性更大,所以酵母和菜花可作为提取DNA 的材料,故A 正确;DNA 在2 mol/ L NaCl 溶液和蒸馏水中,溶解度较大,故B 正确;向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌,鸡血细胞会破裂,因DNA 在蒸馏水中溶解度较大,故不会析出,C 项错误; DNA 溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热,冷却后变蓝,故D 正确。
3.(2011·徐州调研) 如图为“DNA粗提取和鉴定”实验的相关操作。这些操作目的正确的是( )
A .①是洗涤红细胞,去除血细胞表面的杂质
B .②是溶解DNA ,去除不溶于酒精的杂质
C .③溶解DNA ,去除不溶于2 mol/L NaCl溶液的杂质
D .④稀释NaCl 溶液,去除不溶于低浓度NaCl 溶液的杂质
【答案】C
4.DNA 在NaCl 溶液中的溶解度有二重性,随着NaCl 溶液浓度的变化而变化。
(1)请在下列浓度的NaCl 溶液中,选出能使DNA 析出最彻底的一种和溶解度最高的一种
( )
A .0.14 mol/L B .2 mol/L C.0.15 mol/L D.0.3 mol/L
(2)DNA不溶于酒精,但细胞中的某些物质却可以溶于酒精溶液,利用这一原理可以
______________,可以推测溶于酒精的物质中可能有
_______________________________________________。
(3)利用DNA 遇____________呈蓝色的特性,将该物质作为鉴定______________的试剂。
【答案】(1)AB (2)去除杂质 某些盐类、蛋白质、糖类或其他大分子物质 (3)二苯胺 DNA
【解析】 由实验原理可知,DNA 在0.14 mol/L的NaCl 溶液中溶解度最低,有利于DNA 的析出;DNA 主要存在于染色体上,为了把DNA 与蛋白质等其他物质分开,采用DNA 不溶于酒精的方法,从而达到去除杂质的目的;利用DNA 遇二苯胺(沸水浴) 成蓝色的特性,可以鉴定DNA 。
二 PCR 扩增技术
1.简述PCR 原理。
2.补充完整PCR 的反应过程
(1)__________:当温度上升到90℃以上时,双链DNA 解聚为单链,如右图:
(2)__________:温度下降到50℃左右,两种引物
通过碱基互补配对与两条单链DNA 结合,如右图:
(3)__________:温度上升到72℃左右,溶液中的
四种脱氧核苷酸(A,T ,C ,G) 在________________的作用下,根据________________原则合成新的DNA 链,如下图:
思维拓展
1.DNA 复制需要引物的原因:DNA 聚合酶不能从头开始合成DNA ,而只能从3′端延伸DNA 链。
2.PCR 结果:
(1)PCR一般要经历三十多次循环,每次循环都包括变性、复性、延伸三步。
(2)两引物之间的固定长度的DNA 序列呈指数扩增。
典型考题
考情分析:考PCR 原理、原料、步骤、条件,广东高考单独考查较少,多
与《基因工程》相结合,在主观题或者客观题中出现;也有可能和DNA 的组成、结构、复制等相关内容结合,在主观题客观题中出现。
1.要使PCR 反应在体外的条件下顺利地进行,需要严格的控制( )
A .氧气的浓度 B .酸碱度 C.温度 D .大气的湿度
【答案】 C
【解析】 PCR 利用的是DNA 热变性原理,通过控制温度来控制双链的解聚与结合。
2 近十年来,PCR 技术(多聚酶链式反应) 成为分子生物学实验室里的一种常规手段,
其原理是利用DNA 半保留复制,在试管中进行DNA 的人工复制(如图) ,在很短的时间内,将DNA 扩增几百万倍甚至几十亿倍,使实验所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。
(1)加热使DNA 双链打开,这一步是打开_________键,称为_________,细胞中是在
__________的作用下使此键断裂的。
(2)当温度降低时,引物与模板________端结合,在DNA 聚合酶的作用下,引物沿模板延伸,最终合成2个DNA 分子,此过程中原料是_________,遵循的原则是
_________________。
(3)PCR技术的必要条件,除了模板、原料、ATP 、酶以外,至少还需要三个条件,即:液体环境、适宜的__________和____________。
(4)下图为某一次循环的产物,请据图回答问题。
①PCR一般要经历三十多次循环,每次循环可分为__________、__________、__________三个步骤。
②以引物为标记,可判断出此产物最早为第___________次循环的产物。
【答案】(1) 氢 解旋 解旋酶 (2)3′ 四种脱氧核苷酸 碱基互补配对原则
(3)温度 酸碱度 (4)①变性 复性 延伸 ②一
【解析】 蓝色部分为《必修一》、《必修二》内容。
3(2014 广东卷25)利用基因工程技术生产羧酸酯酶(CarE )制剂的流程如图14所示,下列叙述正确的是( )
A、过程①需使用逆转录酶
B 、过程②需使用解旋酶和PCR 获取目的基因
C 、过程③使用的感受态细胞可用NaCl 溶液制备
D 、过程④可利用DNA 分子杂交鉴定目的基因是否已导入受体细胞
【答案】AD
【解析】过程①是以RNA 为模板合成DNA 的过程,即逆转录过程,需要逆转录酶的催化,故A 正确;过程②表示利用PCR 扩增目的基因,在PCR 过程中,不需要解旋酶,是通过控制温度来达到解旋的目的,故B 错;利用氯化钙处理大肠杆菌,使之成为感受态细胞,故C 错;检测目的基因是否成功导入受体细胞的染色体DNA 中,可以采用DNA 分子杂交技术,故D 正确
4(2014 江苏卷 23 )下列关于基因工程技术的叙述,错误的是
A. 切割质粒的限制性核酸内切酶均特异性地识别6个核苷酸序列
B.PCR 反应中温度的周期性改变是为了DNA 聚合酶催化不同的反应
C. 载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因
D. 抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达
【答案】ABC
【解析】限制性核酸内切酶大多是特异性识别6个核苷酸序列,但也有识
别序列由4、5或8个核苷酸组成的,A 错误;PCR 中耐高温的DNA 聚合酶只是在 延伸阶段发挥催化作用,B 项错误;载体质粒上抗生素抗性基因可作为标记基 因,供重组DNA 的鉴定和选择,不是抗生素合成基因,C 错误;目的基因导入
了受体细胞不一定就都能正常表达,D 正确。
5(海南卷31) [生物—选修3:现代生物科技专题](15分)
下面是将某细菌的基因A 导入大肠杆菌内,制备“工程菌”的示意图。
请据图回答:
⑴获得A 有两条途径:一是以A 的mRNA 为模板,在 酶的催化下,合成互补的单链
DNA ,然后在 作用下合成双链DNA ,从而获得所需基因;二是根据目标蛋白质的 氨基酸序列,推测出相应的mRNA 序列,然后按照碱基互补配对原则,推测其DNA 的 序列,再通过化学方法合成所需基因。
⑵利用PCR 技术扩增DNA 时,需要在反应体系中添加的有机物质有 、 、4种脱氧核苷酸三磷酸和耐热性的DNA 聚合酶,扩增过程可以在PCR 扩增仪中完成。
⑶由A 和载体B 拼接形成的C 通常称为 。
⑷在基因工程中,常用Ca2+处理D ,其目的是 。
【答案】(1)逆转录酶 DNA 聚合酶 氨基酸 脱氧核苷酸 (2)引物 (目的基因或A 基因)模板 (3)基因表达载体 (4)使其成为感受态细胞,使大肠杆菌更容易吸收重组DNA 分子
【解析】(1)利用逆转录法合成目的基因的过程是:以mRNA 为模板,在逆转录酶的催化作用下合成单链DNA ,然后在DNA 聚合酶作用下,合成双链DNA 分子;根据蛋白质工程合成目的基因的过程是:根据目标蛋白质的氨基酸序列,推测相应的mRNA 序列,然后按照碱基互补配对原则,推测DNA 中脱氧核苷酸的排列顺序,通过化学方法合成。(2)PCR 过程中需要酶、底物、模板、引物和能量等条件。(3)目的基因和运载体结合,形成基因表达载体。(4)有利用大肠杆菌做受体细胞时,需要先用Ca 2+处理,使之成为感受态细胞,有利于吸收重组DNA 分子
6.(2011江苏) 请回答基因工程方面的有关问题:
(1)利用PCR 技术扩增目的基因,其原理与细胞内DNA 复制类似(如图所
示) 。图中引物为单链DNA 片段,它是子链合成延伸的基础。
①从理论上推测,第四轮循环产物中含有引物A 的DNA 片段所占的比例
为 。
②在第 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA 片
段。
(2)设计引物是PCR 技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注
了部分碱基序列) 都不合理(如图) ,请分别说明理由。
①第1组: ;②第2组: 。
(3)PCR反应体系中含有热稳定DNA 聚合酶,下面的表达式不能正确反映DNA 聚合酶的功能,这是因为 。
(4)用限制酶EcoRV 、Mbo Ⅰ单独或联合切割同一种质粒,得到的DNA 片段长度如下图(1 kb 即1 000个碱基对) ,请画出质粒上EcoRV 、Mbo Ⅰ的切割位点。
【答案】(1)①15/16 ②三 (2)①引物Ⅰ′和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效 ②引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
(3) DNA 聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA 片段的引物链上
(4)见图
【解析】(1)①从理论上推测,第四轮循环产物中含有引物A 的DNA 片段所
占的比例为15/16。②在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的
DNA 片段。(2)某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列) 都不合理,原
因①引物Ⅰ′和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效。②引物Ⅰ′自身折叠
后会出现局部碱基互补配对而失效。(3) DNA 聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA 片段的引物链上。