入侵植物马缨丹的染色体核型分析

目 录

1. 引言 ................................................................................................ 2

2. 材料和方法 ................................................................................... 3

2.1 材料 ................................................................................................. 3

2.2 仪器与试剂 ..................................................................................... 3

2.3 方法 ................................................................................................. 3

3. 结果与分析 ................................................................................... 4

3.1 取材时间 ......................................................................................... 4

3.2 解离时间 ......................................................................................... 4

3.3 染色剂 ............................................................................................. 4

3.4 染色时间 ......................................................................................... 4

3.5 染色体数目 ..................................................................................... 5

3.6 染色体组拍照及核型模式图的制作 ............................................ 5

3.7 染色体相对长度组成及核型分析 ......................................... 6

4. 讨论 ................................................................................................ 7

4.1 马缨丹染色体数目以及长度 ......................................................... 8

4.2 改进之处及其意义 ......................................................................... 8

致谢 ...................................................................................................... 8

参考文献 .............................................................................................. 8

入侵植物马缨丹的染色体核型分析

作者：刘端玉 指导教师：杜道林 教授

（海南师范大学生命科学学院，海口，571158)

摘 要：采用常温制片法对海南岛海口白沙门的马缨丹进行染色体数目统计及核型分析，结果表明: 海南岛海口白沙门的马缨丹的染色体数目为:2n = 2x =22 ，核型公式为:K(2n) =22= 12m + 6sm + 2st ,核型类型为“2A”。

关键词：马缨丹；染色体；核型分析

Analysis on Chromosome Karyotype of Lantana camara

Author：Liu Duanyu Tutor：Professor Du Daolin

((Department of Biology, Hainan normal university，Haikou, 571158)

Abstract :The chromosome number of the Lantana camara was counted by mitotic chromosome specimen and carbol fuchsin staining technique and the karyotype were analyzed. The result shows that the number of the Lantana camara Hitchc was 2n =2x =22, the karyotype formula based on Lantana camara was K(2n) =22 = 12 m + 6sm + 2st,which belong to“2A”type of Stebbins karyotypic symmetry.

Key words: Lantana camara; chromosome; Karyotype analysis

1. 引言

马缨丹(Lantana camara),马鞭草科(Verbenaceae),马缨丹属(Lantana),常绿灌木,因树体微有异味和花色直立灌木或藤状灌木,茎彩多变,故又叫五色梅(华北),五彩花(福建)、臭草、如意草(广东、广西、福建)。原产美洲热带地区,最初是作为一种观赏植物被人为引进我国,后逸为野生因繁殖能力强,植株能迅速蔓延,排挤当地植物,在全球范围内侵占了大面积的牧场、果园和森林,被列为世界上“IUCN100种最严重的入侵生物”之一[1]。

马缨丹(L.camara）在海南分布广泛,生境复杂,覆盖力很强,适应能力强，同时还具有较强的化感作用，抑制其他物种，表现为很强的侵占性，是一种有害的入侵种。繁殖力极强，既能进行有性繁殖，又能进行无性繁殖[2]。由于它的繁殖特性和环境适应性，一旦入侵成功后，要彻底根除非常困难，这不能不引起我们的高度重视。国内外对马缨丹入侵机理的研究主要集中在其化感作用。

迄今为止关于马缨丹属植物的染色体核型分析研究较少，还没有人对海南岛马缨丹核型进行全面的分析，基于海南的特殊地理位置，即岛屿隔离，通过对该

物种染色体核型的分析，可以明确其个体的特性以及种间关系，为探究海南岛马缨丹成功入侵提供细胞学证据，为其防治提供一定参考价值。

染色体核型分析就是通过对染色体标本和其照片进行测量，对比分析，配对，分组排列，对组内各染色体的形态进行测量、描述。从而阐述生物染色体组成的过程，是细胞遗传学、现代分类学和进化理论的重要研究手段[10-12]。核型分析是以显微摄影技术为基础，对细胞染色体数目、形态、大小、臂比指数等进行统计，通过染色体相对长度、着丝点位置、次缢痕及随体的有无等特征的变化，比较分析生物个体的特性。

2. 材料和方法

2.1 材料

所用的马缨丹枝条材料于2008年5月、6月采自海南省海口市白沙门污水处理厂附近，置于沙土中进行扦插生根。

2.2 仪器与试

仪器：420型三用恒温水浴箱(常州澳华)、BCD－238型冰箱（合肥美菱）、三目生物显微镜(重庆澳浦)

试剂：秋水仙素溶液、无水乙醇、冰醋酸、纤维素酶(2 %)、1 mol/L HCl溶液、卡宝品红染料、蒸馏水、二甲苯、香柏油、中性树胶。

2.3 方法

对于核型分析最好选用根尖作为材料。为获取活力，便于观察的根尖，本人采取了三种方法。试验结果表明，取室内培养皿中种子萌发的幼苗根尖，制片后，发现淀粉粒含量过高，严重影响观察；取在光照培养箱MS培养基中培养的幼苗的根尖，得到的根尖活力不够，从而很少看到染色体；取通过野外采集的枝条，扦插于土壤中待生根后，再放到MS营养液中得到的根，根尖活力好，淀粉粒含量少，染色体多，便于观察。因此实验中采用第三种方法对马缨丹进行培养，待根长至2-4cm左右，采用压片法进行染色体制片[13-15]。

2.3.1取样。 从上午7：30-11：30，每隔1h选取1次植株幼嫩根尖，用1%秋水仙素溶液中预处理 2-4 h[8] 后,每个取样时间设4次重复，以确定最佳取样时间。

2.3.2 固定。取出根尖,用无水乙醇与冰醋酸（3:1）固定20-24h 。固定后可将其保存于70%的酒精之中，但是保存时间不能超过一周。

2.3.3 盐酸解离。将根尖置于1mol/L HCl溶液中 60℃恒温条件下解离5、10、15min，以确定适宜解离时间。

2.3.4 纤维素酶解。取出盐酸处理后的根尖，水洗干净后转入约2 %纤维素酶溶液中处理。用清水洗8-10min。

2.3.5 再固定。使酶失活和变性，同时也可以使染色体稍加硬化而利于分散，固定10min-1h。

2.3.6染色。分别用改良苯酚品红，卡宝品红和Giemsa溶液进行染色，以筛选适宜的染色剂。不同的染色剂分别用5、10、15min进行染色，以确定适宜的染色时间。染色后以蒸馏水洗净风干。

2.3.7压片。将材料移至载玻片上，盖上盖玻片，用解剖针或用铅笔的橡皮头在盖玻片上轻轻敲击，使细胞分散，再用拇指轻挤压盖片使组织成为一薄层。

2.3.8 镜检。将压片置于显微镜下观察，选择染色体分散、清晰的细胞进行统计记数，并可照相绘图，以便进行核型分析。同时可用记号笔在载玻片和盖玻片上分别做记号，以便再次观察和照相。选取中期或后期分裂相好的制片,用中性树胶封片后显微照相。

染色体计数和核型分析方法参照李懋学和陈瑞阳(1985)的标准[2]，[22],核型分类按Stebbins(1971)的方法[23]，核型不对称系数的计算用Arano(1962)的方法[13]，

【24]。

3. 结果与分析

3.1 取材时间

试验表明，上午9：00-10：30是观察马缨丹根尖染色体数目的最佳时期[25]，其他取样时间，观察到的中期分裂相细胞所占比例很小，很难从中找出分散较好的染色体分裂相。这可能与该时间段马缨丹根尖细胞处于分裂高峰期、分裂中期相较多有关。

3.2 解离时间

试验表明，马缨丹根尖解离10min，根尖软化程度较好，压片时细胞易分离，染色体分散效果好，观察背景清晰；解离5min，根尖软化程度不够，细胞难以压散，观察时杂质较多；解离15min，根尖软化过度，细胞易破散，染色体过于分散，常造成丢失，给计数带来困难。

3.3 染色剂

3种染色剂对比试验表明，用卡宝品红染色后，只有细胞核和染色体染上紫红色，细胞质不着色，染色体与细胞质对比度最大，效果最佳，拍片效果最好。而用改良苯酚品红或Giemsa溶液进行染色后，染色体与细胞质均着色，染色体与细胞质难分开，拍片效果不好，细胞核染色较浅，背景不清晰，难于观察。

3.4 染色时间

试验表明，5-10min染色效果最好。少于5min染色时间过短，细胞核和染色体着色很浅。而长于10min染色时间过长，细胞核和染色体着色很深。这两种情况都不利于观察和拍照。

3.5 染色体数目

本研究选取了30个中期分裂相良好的细胞观察计数,所有被观察的细胞的染色体数目86.7 %为44条(表1)。因此,确定马缨丹体细胞染色体数目为2n=22，染色体基数为11。

表1 马缨丹根尖染色体数目不同的细胞出现情况

观察细胞总数(个) 染色体数(条) 出现的细胞数(个) 出现率（%）

42 3 10.0

43 1 3.3

30 44 26 86.7

3.6 染色体组拍照及核型模式图的制作

将染色体形态清晰,数目完整,分散良好的细胞进行显微摄影,拍照后测量染色体的长短臂长度等。按照染色体形态大小长短进行配对,配对后按照从小到大的顺序进行排列并编号,制成马缨丹染色体的核型图（1）

标尺为5um

图 1 马缨丹的染色体数目及核型

3.7 染色体相对长度组成及核型分析

将海南海口白沙门附近马缨丹的44条染色体按长度长短排列,求出相对长度和臂比,以Stebbins(1971)的分类方法进行核型分类,制成表格,进行核型分析(表2).从表2可以看出,马缨丹细胞中的44条染色体,除第4、6、9号染色体

为近中部着丝点染色体(sm)，第7号染色体为亚端部着丝点染色体(st)，第5号为含有随体的染色体(m*),其它都是中部着丝点染色体(m),该细胞处于细胞分裂的后期，染色体总数为44条。体细胞的染色总数为22条。染色体组成为 2 n = 2x =22= 12 m + 6sm + 2st,属二倍体植物。马缨丹的染色体组总长度为35.49μm,长臂总长度为21.68μm,短臂总长度为13.81μm,其中1号染色体最短,长度为

2.27μm,11号染色体最长,长度为4.20μm ,最长的11号染色体为最短的1号染色体的1.85倍。根据 Stebbins按不对称性程度对染色体核型进行分类的标准,马缨丹的染色体核型属于2A型，是较对称的，属于相对进化的核型类型。 表2 马缨丹染色体测量数据

编号No. 染色体长度 相对长度 臂比 着丝点

(μm) (%) (长臂/ 短臂) 位置

1 2.27=1.07+1.20 1.7 1.12 m

2 2.57=1.12+1.45 1.93 1.30 m

3 2.65=1.08+1.57 1.99 1.46 m

4 2.95=1.04+1.91 2.21 1.83 sm

5 2.98=1.31+0.47+1.20 2.23 1.27 m*

6 3.00=1.09+1.91 2.25 1.75 sm

7 3.50=0.57+2.93 2.63 5.15 st

8 3.64=1.77+1.87 2.73 1.05 m

9 3.66=1.09+2.57 2.75 2.36 sm

10 4.07=1.60+2.47 3.05 1.54 m 11 4.20=2.07+2.13 3.15 1.03 m

按照实际测量的染色体长臂与短臂长度值绘制染色体核型模式图,使染色体着丝点位于同一水平直线上,短臂在上,长臂在下,染色体由短到长的顺序排列。该模型借鉴于刘国泰、刘雯[22]的东方蓼染色体的核型分析。然后稍加改进，运用Adobe photoshop 7.0和ACDSee软件制成。

图 2 马缨丹核型模式图

4. 讨论

4.1 马缨丹染色体数目以及长度

核型分析是指对生物的染色体数目、大小、形态和随体等特征进行分析。染色体核型分析对细胞遗传学、育种学、分类学、起源和进化等学科的研究有着重要的意义。通过染色体数目、形态和结构差异的分析 ,可以从细胞学水平鉴别物种的差异 ,为研究物种间的遗传距离、亲缘关系和进化提供客观的依据。马缨丹在染色体水平上有二倍体和四倍体两种生物型[15], 黄建辉[22]等认为与二倍体植物相比,多倍体植物具有更大的占据[23]开放生境的能力. 而Sanders RW曾报道了马缨丹的染色体数目极不稳定, 存有2n = 22, 33, 44, 55, 66 多种形式。而本研究所得的马缨丹(L.camara )的染色体数目为2n=22，也观察到个别细胞的染色体数目少于22的现象(表1)。其原因可能是在制片过程中染色体未完全分散，而造成无法辨认；也有可能是染色体不在一个平面上，拍照过程中没有呈现。 通过分析得知:马缨丹(L.camara)染色体平均长度为3.23μm,染色体组总长

度为35.49μm ,根据李懋学等对作物染色体的分类方法 属于小型染色体类型,没有B染色体,中部着丝点染色体较多,核型为“2A”型,是较对称的,属于相对进化的核型类型。 [4]

4.2 改进之处以其意义

在整个实验过程中，观察到的中期细胞少，即含有姐妹染色单体的细胞少，后期细胞多。通过延长秋水仙素处理的时间，此问题也没有得到解决，因此如何得到处于分裂中期的细胞有待于进一步探讨。另由于时间原因，本实验未来得及对海南其它地区马缨丹的核型进行分析。对不同样地马缨丹的染色体数目、大小、形态和随体等特征进行比较，分析不同样地马缨丹染色体的变异情况，从细胞水平进一步探讨马缨丹的入侵机理，这也是今后工作需要解决的问题。

马缨丹属于外来入侵植物,对本地物种的生存和农林业产生了极大的威胁。目前除手工清除外,尚未找到其他有效的清除方法。马缨丹染色体核型的研究可为马鞭草属植物的起源、进化和分类,探索马缨丹的综合利用价值,控制马缨丹的蔓延和危害,为植物资源的开发与利用提供依据，为海南岛探究外来物种入侵机理的研究及防治措施作出一定的贡献。

致谢

在系领导和老师们的关心下，我的工作终于告一个段落。在工作中，得到杜道林老师的悉心指导，朱平学弟大力帮助；以及在野外工作中，林英学姐、戴志聪学长、司春灿学长等研究生的支持，我在此对他们表示衷心的感谢！

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