大豆乙醇酸氧化酶基因的克隆-表达和酶学活性分析
大豆乙醇酸氧化酶基因的克隆\表达和酶学活性分析
摘要:利用RT-PCR 技术, 从大豆叶片总RNA 中扩增了乙醇酸氧化酶(GO)基因的cDNA 序列, 克隆到pMD19-T simple 上, 进行测序, 然后将乙醇酸氧化酶的cDNA 克隆至原核表达载体pRSET-A 上, 转化E. coli BL21,并对该基因在E. coli中的表达进行了研究｡
关键词:乙醇酸氧化酶; 基因克隆; 原核表达; 酶学活性
Cloning and Expression of Soybean Glycolate Oxidase Gene in Escherichia coli and Enzyme Activity Analysis
Abstract: The cDNA sequence of glycolate oxidase(GO) was amplified from the total RNA of soybean leaves by RT-PCR, and then cloned into cloning vector pMD19-T simple. After sequencing, the GO gene was transformed into Escherichia coli expression vector pRSET-a. SDS-PAGE analysis proved that the recombinant E. coli BL21 expressed the predicted 40.8kD glycolate oxidase; and the enzyme activity was also detected.
Key words: glycolate oxidase; cloning; expression; enzyme activity
乙醇酸氧化酶(Glycolate oxidase,GO)[1]广泛存在于菠菜､甜菜､豌豆､西葫芦､莴苣和微生物中, 是植物光呼吸过程中的关键酶, 在植物体内, 与丝氨酸转氨酶(SGT)协同作用, 导致H2O2积累, 杀死病原菌并诱导植物体产生获得性抗性｡乙醇酸氧化酶在过氧化氢酶和乙二胺的存在下能高效催化乙醇酸氧化生成乙醛酸, 乙醛酸是一种重要的有机化工中间体, 是合成香兰素 (芳香醛) ､尿囊素(生物调节剂) ､除草剂､羟氨苄青霉素等医药产品的前体｡以GO 为主要催化剂生产乙醛酸的方法具有成本低､污染小的特点, 是目前生产乙醛酸的首选方法｡国外已有利用E. coli ､酿酒酵母､毕赤氏酵母､汉逊多形酵母等表达菠菜乙醇酸氧化酶, 并将其应用于生产乙醛酸的报道, 国内对乙醇酸氧化酶基因的表达和应用的研究较少｡1990年Ludt 等[2]从兵豆(Lens culinaris)叶片中克隆得到GO 的cDNA, 根据其核苷酸序列反推得到了氨基酸序列, 共371个氨基酸残基, 分子量为40 833D, 与菠菜GO 同源性为93%,其C 端氨基酸残基为P-R-A-P-R-L, 与大豆乙醇酸氧化酶非常相似, 但未对其进行深入的体外表达研究和编码蛋白的酶学活性分析｡因为以菠菜叶子中GO 的含量和活性最高, 所以国内目前仅有菠菜乙醇酸氧化酶在E. coli､酵母中表达的报道, 而未见大豆乙醇酸氧化酶表达的报道｡探索在
E. coli 中表达大豆乙醇酸氧化酶的方法, 为比较大豆乙醇酸氧化酶和菠菜乙醇酸氧化酶的活性差异, 为探索利用大豆乙醇酸氧化酶生产乙醛酸的可行性奠定了基础｡
1材料与方法