有关物质方法学验证

有关物质方法学验证

（HPLC法）

一、检测波长与流动相条件的确定。

一般有国家标准的并不改变国家标准，可直接参照国家标准，可不做。 确实有需要的，检测波长一般用紫外扫描确定，流动相可以多种流动相比较确定，选取其中最合适的。

二、系统适用性

取样品，按照有关物质供试品浓度配制溶液，进样，记录图谱。理论板数应符合规定，分离度应大于2.0或符合规定、拖尾因子应0.8-1.2或符合规定。

有已知杂质并且杂质对照品可获得的：配制6份相同浓度的杂质溶液进行分析，该杂质峰峰面积的相对标准差应不大于2.0%，保留时间的相对标准差应不大于1.0%。另外，理论板数应符合规定，分离度应大于2.0或符合规定、拖尾因子应0.8-1.2或符合规定。

三、专属性

1、空白溶剂干扰试验。

取溶解样品用的溶剂，注入液相色谱仪，记录色谱图。观察溶剂图谱情况。 有辅料的，做空白辅料试验。

2、降解试验

降解对照品溶液：取样品，按照有关物质供试品浓度配制溶液，进样，记录图谱。

高温降解溶液：取样品，按照有关物质供试品浓度配制溶液，于一定温度水浴中放置一段时间，补充溶剂至刻度，滤过，进样，记录图谱。

酸降解溶液：取样品，置量瓶中，加入适量流动相溶解，再加入少量一定浓度盐酸溶液，常温放置或于一定温度水浴中放置一段时间，取出，冷却，加同浓度氢氧化钠溶液调节pH值至中性，再加溶剂稀释至刻度，滤过，进样，记录谱图。有辅料的，做空白辅料酸破坏对照。

碱降解溶液：取样品，置量瓶中，加入适量流动相溶解，再加入少量一定浓度氢氧化钠溶液，常温放置或于一定温度水浴中放置一段时间，取出，冷却，加同浓度盐酸溶液调节pH值至中性，再加溶剂稀释至刻度，滤过，进样，记录谱

图。有辅料的，做空白辅料碱破坏对照。

过氧化氢降解溶液：取样品，置量瓶中，加入适量流动相溶解，再加入少量双氧水，常温放置或于一定温度水浴中放置一段时间，取出，冷却，加溶剂稀释至刻度，滤过，进样，记录谱图。有辅料的，做空白辅料氧化破坏对照。

3、中间体、降解物、已知其它杂质与主成分的分离度试验及定位试验 取中间体配置成一定浓度，进样，记录图谱。取降解对照品溶液，加入少量中间体，进样，记录图谱。

取降解物配置成一定浓度，进样，记录图谱。取降解对照品溶液，加入少量降解物，进样，记录图谱。

取已知其他杂质配置成一定浓度，进样，记录图谱。取降解对照品溶液，加入少量已知杂质对照品，进样，记录图谱。

可接受的标准：空白对照应无干扰，主峰与杂质峰应完全分离，已知杂质峰与其它峰应能完全分离，分离度不得小于2.0。

四、检测限与定量限

一般采用信噪比法。

取对照品，加溶剂稀释至很小浓度，进样，记录图谱，观察信噪比。信噪比10：1，为定量限；信噪比为3：1，为检测限。

有已知杂质并且杂质对照品可得的，须用已知杂质对照品同时做。

可接受标准：杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得小于3。杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得小于10。另外，配制6份最低定量限浓度的溶液，所测6份溶液杂质峰保留时间的相对标准差应不大于2.0%，峰面积的相对标准差应不大于5.0%。

五、线性关系试验

取对照品，配制成一定浓度（大于自身对照浓度）贮备液，精密稀释，或分别精密称样，制备一系列被测物质浓度系列进行测定，至少制备 5 个浓度。

上述被测物质浓度系列，以自身对照溶液浓度为中间浓度，向两边梯度延伸。比如先配制成自身对照溶液浓度两倍的溶液，分别量取3、4、5、6、7ml置10ml量瓶中，即得到相对浓度为60%、80%、100%、120%、140%（相对于自身对照浓度）的系列溶液。取该系列溶液进样，记录色谱图，计算回归方程。

若有已知杂质并且杂质对照品可得的，则取已知杂质对照品另作线性关系试验，供试品中已知杂质峰面积，应在线性范围内。一般，此类线性关系试验浓度从定量限浓度起，至杂质对照品溶液浓度的120%或更高。

可接受的标准为：回归线的相关系数（R）不得小于0.9990。

六、精密度

1、重复性

无已知杂质的。

取样品，配制成自身对照浓度，由同一人员在相同操作条件下，连续进样6次，记录图谱，计算rsd。

有已知杂质的。

取杂质对照品溶液，由同一人员在相同操作条件下，连续进样6次，记录图谱，计算rsd。

可接受的标准为：rsd不得大于2.0%。

2、中间精密度

A、取样品，由不同人员，在不同时间，使用不同仪器，按照测定法测定同一样品的有关物质。计算检查结果的RSD。RSD不大于2.0%。

可以5名人员分别使用5台仪器，于不同工作日测定。仪器也可3台。

B、配制6份杂质浓度（一般为0.1%）相同的供试品溶液，分别由两个分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试。RSD不大于2.0%。

七、溶液稳定性

取供试品溶液，规定条件下放置8小时，分别于0、2、4、6、8小时进样，记录色谱图，观察主峰峰面积变化并计算RSD，观察主要杂质及总杂质峰面积变化并计算RSD，观察是否有新杂质。确定溶液是否稳定，不稳定的应注明立刻进样。

取自身对照溶液同法测定。

有已知杂质的，应另取杂质对照品溶液同法测定。

八、准确度

一般以回收率试验进行验证。无已知杂质的，可不做。

有已知杂质的，须做加样回收试验验证准确度。

例如某杂质的限度为0.2%，取已知杂质含量的样品适量9份，分别加入0.1％、0.2％和0.3％的杂质（各三份），稀释到有关物质供试品溶液浓度。每个样品进一针，记录色谱图。另取杂质对照品，按照标准配制成杂质对照品溶液，进样，记录色谱图。计算回收率。

该项目的可接受的标准为：各浓度下的平均回收率均应在80%-120%之间，如杂质的浓度为定量限，则该浓度下的平均回收率可放宽至70%-130%，相对标准差应不大于10%。

九、耐用性

分别考察流动相比例变化±5％、流动相pH值变化±0.2、柱温变化±5℃、检测波长变化±5nm、流速相对值变化±20％以及采用三根不同批号的色谱柱进行测定时，仪器色谱行为的变化，每个条件下各测试两次。

可接受的标准为：各杂质峰的拖尾因子不得大于2.0，杂质峰与其他成分峰必须达到基线分离；各条件下的杂质含量数据（n=6）的相对标准差应不大于2.0%，杂质含量的绝对值在±0.1％以内。

注：本文多处参考20060208，化药药物评价>>化药质量控制，有关物质分析方法验证的可接受标准简介，黄晓龙。并结合个人平时经验。望指教。

因本人水平有限，错误之处还望指点。大家共同完善本验证方法，以帮助新同仁。