2.2.1小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的制备
小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的制备
北京大学工学院葛子钢实验室
第一次撰写 2008/12/05 汪丽丽 最后修改 2009/06/29 汪丽丽 共3页
目的
培养MEF细胞做饲养层细胞，为胚胎干细胞的扩增提供环境条件。
主要器材
超净工作台 上海力新实业有限，HFSsfe-1200
CO2细胞培养箱 SANYO，MCO-15AC
- 80℃超低温冰箱 REVCO，LEGACI
倒置相差显微镜 Olympus，U-PMTUC
数码照相机 Olympus，C-3040ZOOM
台式高速离心机 Eppendorf，minispin
液氮罐 CBS
各种规格培养板、培养皿 Falcon
细胞培养主要试剂
1. 小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）培养液
DMEM/h（Hyclone, SH30022.01） 85%；
FBS（ Hyclone，30071.03 ） 15%
2. 丝裂霉素C（Sigma, M4287）
饲养层培养液溶解100µg/ml，分装，-20℃保存。
3. Gelatin (Sigma, G2500)
超纯水溶解，1g/L。高压灭菌后，4℃保存。
4. 0.25％trypsin＋EDTA (Hyclone, SH30042.01)
0.25％trypsin：EDTA =1:1
5. 小鼠胚胎成纤维细胞冻存液
小鼠胚胎成纤维细胞培养液 90%；
DMSO (Sigma, D5879) 10%；
小鼠品系
ICR小鼠孕鼠12.5~13.5天
实验步骤
1. 小鼠MEF的制备
1．准备：洗净双手，穿好隔离服，戴好消毒的一次性口罩、帽子，戴上乳胶手套，喷洒酒精消毒。
2. 取材：
⑴ 准备100mm培养皿一个，60mm培养皿两个，小滴管向三个培养皿中均加入PBS，小皿PBS量约4~5滴管，要求皿中PBS能浸泡之后所容组织即可。
⑵ 脱颈处死孕12.5~13.5天的雌鼠：①捉小鼠尾巴，将小鼠取出笼子。②左手揪住尾巴，右手握住剪子用剪子上部按住颈部。③两手向两边用力拉伸，同时右手下压颈部。④腹部朝上喷洒酒精消毒。
⑶ 镊子提起腹部下方的皮肤，剪开小口，向上撕开，镊子提起腹膜剪开腹腔，可见子宫中深红色胚胎连成串，从右侧剪下子宫韧带，连同子宫一起取下，放入装有PBS的100mm培养皿中。
⑷ 用眼科剪沿子宫纵轴剪开胚胎之间连接，使胚胎独立，剪开胎盘、剥去羊膜等胚胎外组织，PBS中洗净，将胚胎移至盛有PBS的60mm培养皿中。
⑸ 记下胚胎数量，两个直头镊子去除胚胎头、内脏及四肢。
3. 清洗：将胚胎剩余部分移入盛有PBS的60mm培养皿中，浸泡洗净。
4. 消化：
⑴ 将胚胎组织移入15ml离心管内，加5ml胰蛋白酶溶液，小滴管吹吸组织到尽量均匀、碎小。37℃温育15分钟，其间每隔5min用吸管吹吸组织均匀、碎小。
⑵ 使消化液自行沉降，如仍有残渣，吸取上层溶液到灭菌容器，用两倍体积血清培养基中和胰酶活性，终止消化。剩余残渣重复此消化过程，最终所有组织基本消化完全，溶液收集到一起。
5. 培养和传代：
⑴ 用饲养层细胞培养液加入收集的溶液中，最终溶液体积为一个胚胎2~3皿，一个皿7~9ml。最初两天为防止污染，可于培养基中添加2倍量双抗PS，以后如不污染，可逐渐减少双抗使用直到不用。轻摇均匀后，吸入100mm培养皿中培养。
⑵ 约2~3天后传代，90%汇合时1：3传代，此代细胞冻存，5代以内的细胞用作饲养层。
6. 冻存和复苏：
细胞冻存：①大皿长满，一皿冻两管。②PBS洗3次，加入胰酶，37℃ 5分钟，加入含血清的培养液终止消化，低速离心洗涤，收集细胞。③加入冻存液，移入冻存管内，置于冻存盒内，-80℃冰箱过夜，次日投入液氮。
细胞复苏：①一冻存管复苏1个100mm培养皿，加入2~3ml饲养层细胞培养液到一离心管。②取出冻存管立即投入37℃水浴，反复摇至液体全部解冻，
将细胞悬液移入离心管的培养基内，离心弃上清，加培养液重悬细胞，移至培养皿内，放入培养箱培养。③复苏细胞长满后用丝裂霉素C处理，传代到明胶培养皿中作饲养层细胞使用。
2. 丝裂霉素C处理MEF细胞
MEF复苏培养3天，长满一个平皿，加入丝裂霉素C（10µg/ml），工作液孵育2小时后吸出，用PBS充分洗涤，作用是抑制细胞有丝分裂但不影响其活性，将灭活细胞直接使用或冻存备用。
使用时，将0.1%明胶溶液均匀铺满培养皿，室温静置2h，吸出明胶溶液，将灭活的MEF细胞约2x106个铺在明胶包被的培养皿上，饲养层细胞培养液继续培养备用。