DNA甲基化.组蛋白去乙酰化与基因表达抑制
临床与实验病理学杂志 JClinExpPathol 2006Jun;22(3)
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DNA甲基化、组蛋白去乙酰化与基因表达抑制
林 洁,来茂德
关键词:表遗传;DNA甲基化;组蛋白去乙酰化;甲基化DNA结合蛋白;DNA甲基转移酶;文献综述中图分类号:R394 文献标识码:A03-0353-05文章编号:1001-7399(2006)
DNA甲基化是指由S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供甲基基团,在DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferases,DNMTs)的作用下,将CpG二核苷酸的胞嘧啶(C)甲基化为5-甲基化胞嘧啶(5-mC)的一种化学反应。DNA甲基化是调节基因转录表达的一种重要的表遗传的修饰方式。一些抑癌基因由于启动子的甲基化而使该基因表达失活从而导致肿瘤发生的
[1]
理论已经被广泛认可。已有研究发现,选择性地结合于甲
化与组蛋白去乙酰化联系起来。MBD1、2、4主要在MBD基序上与MeCP2有同源性,具有优先结合甲基化CpG的能力。MBD1在体外主要优先结合高密度的甲基化DNA,在转染的
[5]
。与这4种蛋细胞中,它通过HDAC依赖的方式抑制转录
白相似,MBD3也包含有高度保守的MBD基序。尽管它与MBD2蛋白有大于70%的氨基酸相似性,却没有特异性结
[6]
合甲基化DNA的能力。
目前已知MBD3是转录抑制复合体Mi2/NuRD(nucleo-some-remodellinghistionedeacetylase)的组成成分。Mi2/MBD3-MBD2间的相互作用而聚集到甲基化区域并发挥作
[7]
。第5种是Kaiso,它不具备MBD基序,通过锌指基序用
[8]
结合甲基化的DNA(主要是CGCG),从而发挥作用。在
基化DNA的特异性的转录抑制子MeCP2(methyl-CpGbind-ingprotein2),即甲基化CpG结合蛋白(methyl-CpGbindingproteins),与组蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylase,HDAC)在细胞中共存于一个复合物中
[2]
这5种甲基化CpG结合蛋白中,MBD1、MBD2、MeCP2和Kaiso具有转录抑制子的功能,并且这种抑制作用绝大部分
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1 甲基化CpG结合蛋白、DNMTs与HDAC
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1.1 甲基化CpG结合蛋白与HDAC 甲基化CpG结合蛋
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[3]
,其靶序列仅仅由白是一组序列特异性的DNA结合蛋白
(5mCpG)。目前已知在哺乳动物中有5种甲基化DNA结合蛋白(图1),其中4种是MeCP2、MBD1、MBD2、MBD4,它们
[4]
(methylatedDNA-bindingdomain,MBD)而结合5mCpG。
MeCP2是最早发现的甲基化DNA结合蛋白。1998年Nan
[2]等在研究中发现,MeCP2能募集(recruit)HDAC。这一发
现有机地把DNA甲基化和组蛋白去乙酰化的功能联系起来。MeCP2含有2个结构域,1个是甲基化DNA结合结构域,另一个是转录抑制结构域(transcriptional-repressiondo-main,TRD)。MeCP2以甲基化依赖的方式结合到染色质上,通过TRD与桥蛋白Sin3A和HDAC的共同抑制复合体紧密联系。该复合体包含有至少7种蛋白,其中有转录抑制
[2]子Sin3A,,Sin3A是一种基因转录抑HDAC1和HDAC2等
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通过一种保守的蛋白质基序即甲基化DNA结合结构域
物
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2个碱基组成:5-甲基化胞嘧啶及紧跟其后的鸟嘌呤
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基化调节基因表达与组蛋白去乙酰化之间有密切的关系。
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。因而有理由认为DNA甲[8]
是通过与HDAC复合体的相互作用而实现的,提示甲基
化抑制基因转录有赖于抑制性的染色质环境。与其他MBD家族成员不同的是,MBD4并不具有抑制基因转录的功能,具有G/T错配糖基化酶的活性和5-甲基化胞嘧啶DNA糖
[9][10]
,因而起着DNA修复的作用。MBDs是基化酶的活性
DNA甲基化模式与组蛋白修饰之间的桥梁,在肿瘤发生的
[11]
表遗传通路上起重要的作用。
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上排方框是包含MBD结构的蛋白,下排方框的Kaiso通过锌指结构结合DNA。蛋白质按功能分类:结合甲基化CpG的转录抑制子有MBD1、MBD2、MeCP2和Kaiso;MBD3是Mi/NuRD共同抑制子复合物的非DNA结合成分;MBD4是G-T错配糖基化酶
制因子,它的参与可引起基因失活。该复合体将DNA甲基
收稿日期:2005-10-14 修回日期:2006-01-09
作者单位:浙江大学医学院病理学与病理生理学系,杭州 310006作者简介:林 洁(1977-),女,博士研究生
来茂德(1960-),男,教授,博士生导师,主要从事肿瘤分子病理学的研究,通讯作者。Tel:(0571)87217134,E-mail:[email protected]
1.2 DNMTs与HDAC DNMTs是DNA甲基化反应的催
[12]
。DN-化剂,在染色质重构和基因表达调控中起关键作用
MTs的结构主要由3部分组成,即N端调节结构域、C端催
[12]化结构域和中间的连接部分。目前,在真核生物中发现
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图1 哺乳动物中的甲基化CpG结合蛋白
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NuRD同时具有染色体重构和组蛋白去乙酰化的活性,通过
[13]
了3类DNMTs,即DNMT1、DNMT2、DNMT3A/DNMT3B。MeCP1是甲基化结合蛋白,但是后来发现它不是1个单一的蛋白质,而是1个蛋白的复合体,即主要由MBD3、MBD2、HDAC1/2和RbAp46/48(Rb-associatedhistone-binding
[7]
protein46/48)等所组成。因而本文未将它归为甲基化
DNMT1主要是维持DNA的持续甲基化状态(maitenancemethylation),即使半甲基化的双链DNA变成完全甲基化的
[14]
双链DNA;DNMT3主要是参与DNA的从头甲基化(de
novomethylation),即催化非甲基化的DNA成为甲基化的DNA状态
[15]
DNA结合蛋白中。MeCP1需与12个甲基化CpG位点结合,才能起转录抑制的作用,因而它的抑制转录的作用比较
[20]
弱。而MeCP2只需与1个甲基化CpG位点结合就能发[21]
,并且MeCP2含有2个结构域,即染色挥抑制转录的作用
;DNMT2具有催化区域,可与DNA上的特异位
点结合,但它没有完整的调节区域,因而不具备甲基转移酶活性。DNMT1和甲基化CpG结合蛋白之间的物理联系已经报道。DNMT1能与MBD2和MBD3免疫共沉淀成为1个潜在的复合体。MBD2和MBD3是大分子MeCP1抑制子复合体的成分。该复合体在体外能优先结合、重建和去乙酰化含
[16]
有甲基化DNA的核小体。DNMT1还能直接与HDAC1/2[17]
。MBD2-MBD3复合体以去乙酰化酶抑制剂曲相互作用
体定位必需的甲基化CpG结合结构域和在一定距离内可抑制启动子转录的转录抑制结构域(TRD),因而它抑制转录的作用就比较强。MeCP2也可以与转录因子竞争结合位点,通
[22]
过不依赖于HDAC的方式抑制基因的转录。(3)DNA甲
基化通过改变染色质结构,抑制基因表达。染色质构型的变化伴随着组蛋白的乙酰化和去乙酰化。目前已证实,DNA甲基化与组蛋白去乙酰化正相关。而乙酰化修饰正是调节
[23]
。基因表达的另一重要方式
古抑菌素TSA敏感的方式在半甲基化和完全甲基化的DNA以及抑制的转录中显示了结合亲和力。因而,这些结果提示存在最大的“all-in-one”型转录抑制复合体的可能性。也就是说,由1个DNA修饰单位(DNMT)、1个甲基化胞嘧啶识别单位(甲基化CpG结合蛋白)和1个组蛋白修饰单位(HDAC)共同组成了1个“allinone”型的转录抑制复合体,并且该复合体通过3个亚单位间的相互作用,在指引DN-MT1募集到DNA复制后半甲基化的序列、在S期使基因表达沉默、或者使新组装的组蛋白去乙酰化等方面起重要作
[13]
用。
2 DNA甲基化抑制基因表达的机制
在非肿瘤细胞研究中,至少有3组功能性研究的实验数
[18]
:首先,体外据支持DNA甲基化是导致基因静止的原因
的细胞中的表达;其次,用甲基转移酶抑制剂5-aza-dC去除甲基化可以导致原先甲基化的基因再表达;最后,Dnmt1纯合缺失的小鼠胚胎可以再表达很多基因,包括通常静止的一些印迹基因、大量存在但通常抑制的内源性的逆转录病毒序列等,而在杂合性的同窝出生的小鼠中,这些基因是甲基化并且不表达的。
DNA甲基化主要在转录水平抑制基因的表达。DNA甲
[19]
:(1)DNA基化引起基因转录抑制的机制主要有以下3种
甲基化直接干扰特异性转录因子与各基因启动子中识别位置的结合。DNA轴的主沟是许多蛋白因子与DNA结合的部位,当胞嘧啶被甲基化后,5-mC突出至主沟中,干扰转录因子与DNA的结合。目前已知许多转录因子都对其同源结合位点的甲基化敏感,如E2F、AP2、NFkB等。当然也有一些转录因子不受甲基化的影响,如SP1、CTF等,它们被称为甲基化非依赖性结合因子。由于含有CG结合位点的转录因子并不多,所以这种机制并不常见。(2)序列特异性的甲基化DNA结合蛋白与启动子区甲基化CpG岛结合,募集一些蛋白,形成转录抑制复合物,阻止转录因子与启动子区靶序列的结合,从而影响基因的转录。如甲基化胞嘧啶结合蛋白1和2(MeCP1和MeCP2)及MBDs。早期的研究曾认为
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物秀
构建甲基化启动子的报告基因,可以抑制该基因在随后转染
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具有高度亲和性。因此DNA与核心组蛋白紧密结合,从而阻碍了基本转录单位蛋白质复合物进入启动子结合位点,导致转录功能受到抑制。而组蛋白乙酰基转移酶(HAT)则具有乙酰化的作用,它将乙酰辅酶A上的疏水乙酰基转移到组蛋白N端赖氨酸的ε-氨基上,从而中和了其正电荷,增加了疏水性,使DNA与组蛋白之间的静电引力和空间位阻增大,削弱了DNA与组蛋白的相互作用,有利于转录因子与DNA的结合,从而促进转录。因而,组蛋白的乙酰化修饰在基因的转录调控中起着非常重要的作用。
3.2 DNA甲基化与组蛋白去乙酰化协同抑制基因转录 在DNA甲基化抑制基因转录的三种机制中,组蛋白去乙酰化参与了后两种机制的运作。以MeCP2为例,当启动子区的CpG发生甲基化时,MeCP2与甲基化的CpG结合后,再与Sin3A结合,进一步与异二聚体Mad/Max形成复合物,该复合物募集HDAC,形成一个共同转录抑制因子。HDAC使组荷的DNA紧密结合,染色质变得结构紧缩,从而阻碍了基本转录单位蛋白质复合物进入启动子结合位点,导致转录抑
[24][17]
制。Faks等通过实验证明了DNMT1能直接与HDAC
[26]
。这一研究同样提示了DNA使用TSA则不能使其激活
甲基化在转录调控中占主导地位,它可以通过不依赖于组蛋白去乙酰化的方式抑制基因的转录。
[13]
3.3 转录抑制模型的建立 Robertson提出了HDAC、
ATP依赖的染色质重构酶及DNA甲基转移酶是如何共同合作建立区域特异性的DNA甲基化模式的模型(图3)。首先,位于转录区域或转录调控区域的组蛋白首先去乙酰化(和潜在的甲基化),这样可能起始转录静止。然后,染色质重构子识别这个染色质,以ATP依赖的方式移动核小体,并允许DNMT接近它的靶DNA位点或产生一个特殊的染色质标记(signature)或表位(epitope),使它能被DNMT或包含DNMT的复合体所识别。一旦这个区域甲基化,甲基化的胞嘧啶会恢复甲基化DNA结合蛋白和相关的共同抑制子的活性来进一步强化转录静止和染色质紧缩状态。
结合,并确定了特异性结合位点,这一发现更直接地证明DNA甲基化与组蛋白去乙酰化之间的协调作用。
可见,启动子区DNA甲基化与组蛋白去乙酰化之间具有协同抑制基因转录的作用。但是组蛋白去乙酰化抑制基
[25]
因转录的作用依赖于甲基化CpG位点的数目。Currdi[25]等在研究中发现,当发生甲基化改变的启动子区域的
CpG位点的数量不足以引起长距离的基因抑制的时候,组蛋近启动子的地方仅有几个二核苷酸发生甲基化时,这些甲基化的CpG能提高MBD的活性及与他们相联系的HDAC的活性。此时,组蛋白发生去乙酰化,并使核小体的结构紧缩,于是转录抑制。在这种情况下,组蛋白去乙酰化的协同抑制
物
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白去乙酰化在抑制基因表达上将发挥重要的作用。如当靠
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图3 去乙酰化、染色质重构、甲基化和转录抑制的模型
生
发挥着决定性的作用,因为用TSA处理可以使因甲基化而静止的基因恢复表达,抑制被解除。说明了甲基化所致的染色质结构的紧缩不够稳定,不足以维持这种紧缩的状态。因而在启动子区mCpG低密度的情况下,转录抑制主要归功于组蛋白去乙酰化途径。
当发生甲基化的启动子区域的CpG位点的数目增大至可以引起基因广泛静止的阈值的时候,这种抑制的机制将会有明显的不同。在这种情况下,通过MBD蛋白和其他结构性和重建性的活性所形成的特异的染色质结构将会在改变的DNA上形成。接着,这种染色质结构紧缩并向周边未改变的DNA蔓延。此时,组蛋白去乙酰化对转录抑制的作用是次要的了,因为用TSA处理,转录水平仍明显低于未甲基化的对照。说明在这种情况下,高密度的甲基化使染色质结构高度紧缩并且相当稳定。
此外,在结直肠癌和白血病细胞系的研究中发现,高甲基化的、转录静止的基因通过组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA和DNA甲基转移酶抑制剂5-aza-dC处理后能再活化,但仅
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4 临床应用
DNA甲基化和组蛋白去乙酰化都可以引起基因的转录抑制,这种调控机制是可逆的,因而对肿瘤临床治疗来说是非常令人振奋的靶点。目前,DNA甲基化酶抑制剂和组蛋
[27~30]
白去乙酰化酶抑制剂都已经应用于临床。例如,应用
DNA甲基化酶抑制剂治疗镰状细胞贫血病可使患者的血红
[31]
,在治疗骨髓增生异常综合征蛋白和γ球蛋白显著增加
[32]
方面也取得显著疗效。组蛋白去乙酰化酶抑制剂苯丁酸[33,34]
。因在临床上已用于治疗白血病和一些实体瘤患者
此,通过DNA去甲基化和组蛋白乙酰化的途径治疗肿瘤具有广阔的前景。5 结论
已有较多的研究指出通过DNA甲基化所致的基因转录抑制涉及到组蛋白去乙酰化。MeCP2和具有去乙酰化组蛋白能力的多蛋白复合体之间的联系为基因转录抑制提供了一种可能的分子机制。当然也有一些研究指出,由CpG岛
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蛋白去掉乙酰基,恢复核心组蛋白所带的正电荷,与带负电
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甲基化所致的基因静止在没有用去甲基化剂5-aza-dC使DNA部分去甲基化之前不能被TSA恢复活性。这也说明了甲基化所起的作用较组蛋白去乙酰化居于主导地位。
CpG二核苷酸中的胞嘧啶甲基化是人类基因组中最主要的表遗传改变。抑癌基因启动子区域CpG岛的甲基化通过一个涉及组蛋白去乙酰化和染色质紧缩的复杂过程而导致转录抑制。表遗传改变也是一个致癌事件,在功能上等同于遗传改变如碱基的突变和缺失。但是与遗传学改变不同的是,表遗传学的改变是可逆的。通过使用DNA甲基化酶抑制剂和HDAC抑制剂可以使因表遗传静止的基因恢复活性,从而逆转肿瘤的恶性表型或延缓肿瘤的进展。表遗传修饰可逆的特性提示它可作为肿瘤患者进行治疗的靶标,因而对导致肿瘤的表遗传机制将进一步认识为肿瘤治疗提供新的方法,并且启发我们更合理地使用抗癌药物。参考文献:
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临床与实验病理学杂志 JClinExpPathol 2006Jun;22(3)
・357・
组织芯片技术应用新进展
杜卫东
关键词:组织芯片;病理学诊断;文献综述中图分类号:R394.33 文献标识码:A文章编号:1001-7399(2006)03-0357-04
组织芯片又称组织微阵列(tissuemicroarray,TMA),它是将数十个乃至数以千计不同来源的组织样品粘贴到同一张固相载体如玻璃片或硅片上,形成组织微阵列。在同一反应条件下进行免疫组化染色、原位杂交、FISH和原位PCR等以了解病变组织与相应正常组织内靶基因或蛋白质的细胞来源、分布特征和表达差异等。它的最大便利之处在于可以对大量组织标本同时进行检测,缩短了检测时间,减少了不同染色玻片间人为造成的差异,使得各组织或穿刺标本间对某一生物分子的测定更具有可比性。TMA技术克服了传统形态学方法(如无法同步大规模筛选靶基因或蛋白质表达、组织切片费时及染色试剂消耗量大等)、分子生物学方法(如无法确定生物组织内靶基因或蛋白质的细胞来源及组织分布等)和基因芯片技术(如需用新鲜组织和细胞制备cDNA、芯片检测费用昂贵等)单一使用所存在的某些技术缺陷,能够有效地利用一些珍贵的病变组织或穿刺标本来研究
上的又一热点并逐渐成为推动基础研究向临床应用转换的重要手段。本文拟就近年来TMA在生物医学研究中的应用现状作一简要综述。
1 TMA在生物医学研究中的应用现状1.1 TMA在肿瘤研究中的应用
1.1.1 TMA在肿瘤诊断中的应用 弗林蛋白(furin)可以激活生长因子、生长因子受体、黏附分子以及基质降解酶并
[2]
促进肿瘤的进展。Lopez等利用TMA技术对118例口腔、
表达,提示弗林蛋白可以作为监测这些器官鳞状细胞癌发生、发展的一种标记物。
在寻找甲状腺乳头状癌(PapillaryThyroidCarcinoma,
[3]PTC)肿瘤诊断标记物的过程中,Prasad等曾利用TMA和
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特定基因及其相应蛋白质的表达规律以及与疾病之间的相互关系。这对于核酸和/或蛋白质表达的研究,对疾病的分
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子诊断、治疗靶点的定位、预后指标的筛选、治疗效果的预测、新药的开发与筛选以及形态学教学工作等诸多方面均具
[1]有十分重要的实用价值。自1998年Kononen等首次描述
生
这项技术目前已成为肿瘤等组织方法学研究TMA以来,
收稿日期:2005-08-22 修回日期:2006-01-12基金项目:安徽省“十五”高校学科拔尖人才基金资助
作者单位:教育部重要遗传病基因资源(利用)重点实验室、安徽医
科大学皮肤病研究所,合肥 230032
作者简介:杜卫东(1958-),男,博士,教授。E-mail:[email protected]
CritRevOncolHematol,2005,55(1):1-11.
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多抗CITED1(一种核转录调节蛋白)抗体对甲状腺和非甲状腺肿瘤进行免疫组化染色,结果发现CITED1蛋白质专一性在PTC中表达(93%,63/68)。正常甲状腺、毒性甲状腺增生和间变性甲状腺肿瘤CITED1均为阴性。非甲状腺肿瘤CITED1反应不一。值得一提的是,所有卵巢肿瘤(49例)CITED1均呈阴性反应。CITED1被用于PTC与其他病变(如良性甲状腺结节、其他类型甲状腺肿瘤以及非甲状腺肿瘤鉴别诊断的准确率分别为93%、89%和94%。由于CITED1蛋白质的这种特性使得它可以作为PTC诊断的一个重要的肿瘤标记。
1.1.2 TMA在肿瘤分类中的应用 乳腺癌是一个非常特殊的生殖系统肿瘤,其组织学类型、肿瘤细胞功能状态以及雌激素受体(ER)表达不同,患者临床治疗及预后迥异。
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利用TMA分析乳腺癌ER、血管内皮生长因子Zhang等
(VEGF)、Cox-2、p53、PDGF、c-erbB2及PR等肿瘤标记物免疫组化表达谱,按ER状态和肿瘤等级不同把97例乳腺癌先分成ER+和ER-两组,然后根据VEGF的不同再进一
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疫组化染色,鳞状细胞癌和癌前病变中弗林蛋白均呈高水平
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肺和食道鳞状细胞癌及其34例相应的癌前原位病变进行免