实验三 培养基的制备 潘国民
实验三 培养基的制备
点名, 查看学生出勤情况。总结上次作业,提出作业中出现的问题并讲解。 一、说明几点问题:
阐明微生物学研究工作中具有重要的地位,而培养基的制备在微生物学研究中的重要性。
(一)什么叫培养基:
根据生物生长、繁殖的生理要求,人工配制适宜的营养物质以培养微生物就叫培养基。常用于分离、培养、鉴定和研究各种微生物。 (二)培养基的种类:
培养基的种类很多,按其制成的物理形状分为液体培养基、固体培养基和半固体培养基三种。按其物质来源分为合成培养基和天然培养基两类。前者是指由已知化学成分的纯粹化学物品配成的培养基,如察氏培养基等;后者指由化学成分复杂的天然物品配成的培养基,如一些动植物的组织、器官(马铃薯、胡萝卜、肉类、蛋等)切块或浸出液,以及用作培养病毒、立克次氏体等的动物机体、胚胎和活组织细胞等。另外,常依其用途分为普通培养基、专用培养基和鉴别培养基。
(三)制作培养基应注意的几点问题
1. 培养基内须含有培养菌所需的营养物质,所有化学药品必须纯净,称量务必准确。实验中所用的Nacl, 是分析纯而不是生活中所使用的食盐。
2.pH 值应按各种培养基的不同要求而测定。
3. 所制的培养基应透明,以便易于观察培养菌的培养性状。 4. 所有器皿须洁净,忌用铁制或铜制器皿。
5. 培养基的灭菌时间和温度,应按照各种培养基的规定进行,以保证灭菌效果及不损培养基的必要营养成分。培养基经灭菌后必须放37℃温箱中培养24h ,无菌生长者方可应用。 (四)需要的原料及其作用 1、基本营养物质
⑴水 配置培养基时,一般使用天然水即可,严格要求时,应使用蒸馏水。
⑵蛋白胨 是蛋白质经蛋白酶、酸或碱水解后的中间产物,含有胨、肽和氨基酸等成分,主要是供给微生物所需要的氮素营养等。因为它是两性化合物,所以也有缓冲作用,可维持培养基PH 的稳定。
⑶肉浸汁、牛肉膏和牛肉粉 肉浸汁一般加入牛肉的水浸液或其浓缩物,供作微生物氮素、碳素、灰分元素和生长辅助因素的营养来源。
⑷盐类 一般加入氯化钠或磷酸盐等以供给灰分元素营养。磷酸盐等兼有缓冲作用,可维持培养基PH 的稳定;氯化钠则常兼作调节渗透压的作用。
⑸糖类、醇类 糖类和醇类等包括许多种,常用葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇等供微生物做碳源,以观察其利用和发酵反应情况。
2、特殊需要物质 常用血液、血清、腹水、组织碎粒 、鸡蛋等物加入专用培养基中,以提供特殊的碳、氮和生长辅助因素营养, 满足某些微生物的特殊需要。
3、附加物质
⑴ 琼脂 系由海藻中提制出的一种半乳糖硫酸酯。它在98℃时能溶化于水,温度降至45℃以下时则重新凝成凝胶状。琼脂在培养基中含量在1.5%以上时呈固体状态,在0.5%左右时呈半固体状态。一般微生物都不能分解利用琼脂,它在培养基中只作固形剂用,以便分离与观察菌落特征。
⑵ 明胶 系一种动物蛋白质,由动物的筋、腱等组织提制而得。它不溶于冷水,与水一起加热到25℃时即溶化,冷却后可凝成凝胶。明胶的硬度很低,不能像琼脂那样用作固形剂。一部分能产生胶原酶的细菌可使明胶液化,因此,它可用作微生物的生化特性鉴定。
⑶ 指示剂 在培养基中加入适当的指示剂,可用观察pH 的变化或其他反应现象,从而显示培养过程中某些物质的利用和转化情况。常用的指示剂有酚红、酸性复红、溴麝香草酚蓝等,醋酸铅则是显示硫化氢的指示剂。
⑷ 抑菌剂 在培养基中加入适当的抑菌剂,可以抑制其他杂菌的生长,而有利于目的菌生长,方便增菌、鉴别和分离培养。结晶紫、抗菌素、孔雀绿、煌绿、胆盐等都是常用的抑菌剂。
(五)制备过程
1、原料称取和溶解 按所制培养基的配方(),准确称取各种原料,置于容
器中,加入蒸馏水,混合 ,加热, 若为几种盐类,最好待一种完全溶解后再加入另一种。
2、 酸碱度(pH )的测定
测定pH 常用pH 试纸、比色法。较准确的用标准比色法或用酸度计。标准比色法的操作步骤如下:
1)取与标准比色管大小一致的试管3支,其中1支盛蒸馏水5ml, 另2支各盛被检培养基5 ml ,并加入0.25ml 酚红指示剂于一管培养基内作比色,另一管不加指示剂作对照。将此3管与欲测定的pH 标准比色管,分别安置于比色箱中。
2)对光观察,徐徐加入N/10Nacl(酸性时)或N/10Hcl(碱性时)溶液于其中,至其颜色与标准比色管相同为止。此时培养基的pH 便和标准比色管的pH 相等。记录其所用的碱或酸溶液量。 计算:
待测培养基的总量×测定时用过去的氢氧化钠或盐酸量
用作测定的培养基量
=全部待测定培养基内应加入的氢氧化钠或盐酸液量
由于需要加入的N/10NaOH溶液太大,可换算成一个当量溶液加入。
3、 过滤、分装和灭菌
1)棉花过滤法 取脱脂棉一块,剥离为2~3薄块,然后纵横相叠,并把棉花浸湿,轻轻压入漏斗底部。注入培养基时应在棉花的中央,不可沿漏斗壁注入,且不宜倾注太快。液体培养基、煮溶的琼脂培养基都可此法过滤。
2)滤纸过滤法 取一张与玻璃漏斗适当大小的滤纸,摺成漏斗状 ,套入漏斗内,注入培养基时沿一支玻璃棒流到滤纸上过滤。一般不太混浊的液体培养基可采用滤纸过滤。经棉花过滤而不够澄清者,也可再次用滤纸过滤。
边过滤边按需要量分装试管或三角瓶,或过滤后分装。加试管塞或瓶塞,用牛皮纸包扎,写好培养基名称、制备日期后,按培养基种类、性质要求进行灭菌。
4、 灭菌效果检验、保存 灭菌后的培养基,冷却后放入4℃冰箱,抽几支试管或1~2瓶放37℃温箱培养24~48h ,若均无菌生长,为合格。若有菌生长,则应检查原因,并将同批灭菌培养基再进行灭菌、检验,合格后放4℃冰箱保存备用。
(六)普通肉汤、琼脂培养基的制作方法 1、肉汤培养基的制备
1)原料:牛肉膏0.3%,氯化钠0.5%,蛋白胨1%。 2)制法:
①将牛肉除去筋腱和脂肪后切成小块,放绞肉机中搅碎,称重,每500g 牛肉加水1000ml ,搅拌后,放置普通冰箱内浸泡一夜。
②次日取出,煮沸半个小时,并用玻璃棒不断的搅拌,不使沉于锅底;注意以蒸馏水补充其蒸发的水分。
③用洗净的白棉布滤过,将滤过液再经过脱脂棉滤入适当容量的烧瓶中。 ④在滤过液中1%蛋白胨及0.5%氯化钠,并加热溶解之。
⑤用N ∕10氢氧化钠校正滤液的ph 值至7.6-7.8后,再加热10min 。 ⑥用滤纸过滤,使培养基澄清。
⑦分装于试管或三角瓶中,塞好棉花塞,经15磅30min 灭菌,取出经无菌检验合格后备用。
2、普通琼脂培养基的制备
1)原料:普通肉汤100ml ,琼脂2.0g 。 2)制法
①将琼脂按2%的比例加入普通肉汤中。
②加热溶化后,调整其ph 值为7.6-7.8,再加热10min 。
③用脱脂棉花过滤,分装于试管或三角瓶中,经15磅30min 灭菌。 ④将已灭菌好的琼脂试管取出,趁热斜置于斜面架或木棒上,使呈适当的斜度,将凝固后即成琼脂鞋面培养基。
⑤若制作琼脂平皿,可将已灭菌而融解的琼脂培养基,趁热倾注于灭菌的培养皿中(盖子不要开得太大,以免污染),一般90mm 直径的培养皿约分装15-20ml ,倾入后即行盖闭,再轻轻摇动培养皿,使其中的培养基分布均匀,然后让其静置,待凝固后,翻转放置37 ℃恒温箱中培养24h ,应无细菌污染,始可应用。 二、板书
实验三 培养基的制备 一、 目的要求:
1. 掌握一般培养基制备的原则。 2. 熟悉培养基制备的过程。 二、 实验内容:
1. 每组先制200ml 普通肉汤培养基。
2. 将已制好的肉汤每人分装一试管,每管5ml ,加塞包好。
3. 将剩余的肉汤以1.5%的比例加入琼脂粉,加热溶解后装入三角瓶。 4. 用已制好的普通琼脂培养基,每人分装1支试管,每管5ml ,加塞。将上述各种培养基包好并注明班组,以121.3℃高压后备用。 三、 作业:
1. 如何修正培养基的酸碱度。 2. 简述普通肉汤培养基的制备方法。
0.5%NaCL,0.3%牛肉粉(膏),1%蛋白胨。称量后加入一定量的水,于电炉上加热充分溶解,调节酸碱度后用滤纸过滤,分装后高压灭菌。
制得的普通肉汤培养基按1.5%的比例加入琼脂粉后于电炉上再次加热反复沸腾3–4次,补充水分后分装或装入三角瓶灭菌备用。
pH 值的调节
用1ml 吸管吸取0.1N NaOH1ml,滴定5ml 液体培养基,计算出所配制的肉汤需用的量,再换算为1N NaOH加入其中。 三、示教部分
1. 配制100ml 培养基,准确称取0.5gNacl 、0.3g 牛肉膏、1g 蛋白胨。 2. 用量筒量取100ml 蒸馏水,加到白瓷杯中, 放到电炉上加热沸腾,并用玻璃棒搅拌加速其溶解,直至完全溶解,消耗的水分,及时补充。
3. 先用pH 试纸粗略测定pH 值,然后用标准比色法来调节培养基的pH 为7.2-7.8之间。
4. 取与标准比色管大小一致的试管3支,其中1支盛蒸馏水5ml, 另2支各盛被检培养基5 ml ,并加入0.25ml 酚红指示剂于一管培养基内作比色,混合均匀。另一管不加指示剂作对照。将此3管与欲测定的pH 标准比色管(一般取pH 为7.4的比色管),分别安置于比色箱中。
5. 对光观察,然后加酸或碱调准PH 值。如偏酸,用1ml 吸管吸取0.1N
NaOH1ml ,徐徐加入加过指示剂的待滴定的5ml 液体培养基中,至其颜色与标准比色管相同为止。此时培养基的酸碱度便和标准比色管中的酸碱度相等。记录其所用的0.1N NaOH的溶液量。如偏碱,则按同样方法加Hcl, 来调节酸碱值.
6. 计算:
待测培养基的总量×测定时用过去的氢氧化钠或盐酸量
用作测定的培养基量
= 全部待测定培养基内应加入的氢氧化钠或盐酸液量
(由于需要加入的N/10NaOH溶液太大,对培养基的总体积会有影响,可换算成一个当量溶液加入。)
计算出所配制的肉汤需用的量,再换算为1N NaOH加入瓶中。 7. 再用pH 试纸粗略测定其pH 值。 8. 过滤已调好酸碱度的普通肉汤培养基。
9. 按每管5ml 分装,加塞。(同学操作时要求每人一管,以备下次实验使用。) 10. 将剩余的肉汤以1.5%的比例加入琼脂粉,加热溶解后,沸腾3~4次,加热过程中应不停的用玻璃棒进行搅拌,防止下底部温度过高,使培养液变糊。
11. 要求每人分装1支试管,每管5ml ,加塞,剩余的培养基装入三角瓶中以备作斜面培养基用。
12. 将上述分装好的培养基以组为单位包扎好,并注明班组,以121.3℃高压后置于温箱中进行空白培养。 五、实验中应注意的问题
1.准确称量制备培养基所需的化学药品。
2. 测定培养基的pH 值时要准确,要将其控制在适宜细菌生长的范围内pH 7.2-7.8,以防细菌不能正常生长。
3. 调节pH 值时,用带刻度的吸管,应缓慢加入,每次加入量不可过多,以免加入过多,造成不必要的麻烦,引起测量不准确。
4. 在包扎的报纸上,注明实验时间组别,以便在下次做实验时查找。 六、作业及要求
1. 详细回答如何修正培养基的酸碱度。简述普通肉汤培养基的制备方法。 2. 认真、按时完成作业。
七、本次实验总结
所有同学务必熟练掌握培养基的制备过程,这关系到后两次实验的顺利进行。
八、附:实验所需物品
一、试验材料名称 组别 数量 合计 备注 1、药品:NaCl 、蛋白胨、牛肉膏、琼脂粉各1瓶 2、蒸馏水、 3、量筒
4、天平 2 5、试管架 5 1 56、漏斗架 5 1 57、滤纸 5 1 58、漏斗 5 1 5 9、中号试管 5 12 6010、试管塞 5 12 60 11、称量纸
12、PH 试纸 5 1 5
个 个 张 个 支 包
表1、试验仪器设备统计表
学院牧医工程 实验室名称畜牧微生物 实验名称实验三培养基的制备
表2、试验试剂消耗情况统计表
表3. 实验用低值易耗品及实验动物统计表
系别: 牧医 实验室名称: 畜牧微生物 实验名称: