大肠杆菌肽酶D的重组表达和晶体生长
第22卷第3期2005年6月
生物学杂志JOURNA L OF BI O LOGY
Vol. 22 No. 3Jun ,2005
大肠杆菌肽酶D 的重组表达和晶体生长
张 敏1,2, 葛宏华1,2, 徐峰峰2
(1. 安徽大学生命科学学院, 合肥 230039;2. 中国科学技术大学生命科学学院, 合肥 230026)
摘要:用PCR 技术扩增大肠杆菌肽酶D (pepD ) 的基因, 并将扩增基因克隆于原核表达载体pET -22b 中, 获得该蛋白的可溶性高效表达。通过镍亲和层析柱一步纯化后可得电泳纯的重组蛋白。该蛋白为二体形式, 每个单体含有一个锌原子。用“悬滴气相扩散法”对该蛋白进行晶体生长, 获得单晶。关键词:氨酰-组氨酸二肽酶; 重组表达; 金属蛋白酶; 晶体生长中图分类号:Q51,Q78
文献标识码:A
文章编号:1008-9632(2005) 03-0023-02
锌金属蛋白酶是一类可催化蛋白质或多肽链肽键
断裂的水解酶, 其中最典型的为羧肽酶A 和嗜热菌蛋白酶。尽管这两种酶来源不同, 且序列和空间结构差异显著, 但催化活性部位的结构非常类似, 都含有一个具催化活性的锌原子, 酶蛋白具有HEXXH 序列等[1,2]。近些年来, 含有两个或更多锌原子的蛋白酶被认识和研究, 因此含不同锌原子数目的蛋白酶在锌的配位结构、,4]大肠杆菌K 12-histidine ,EC 3. 4. 13. 3) , 是一种含, 属于M25肽酶家族(peptidase family M25) 。肽酶D 和细菌中其他肽酶一
μ1L 为模板, 上游和下游引物各μl m ol/L , ExTag 酶。PCR 反应条件:94℃3分钟;94℃40秒,55℃50秒,72℃1
分钟30秒,35次循环;72℃10分钟。切胶回收PCR 产物,37℃, Nde I 和Xho I 双酶切过夜。酶切产物用酚氯仿纯化后, 与pET -22b ℃连接过夜, 连接, 筛选转化子, 提。1. 样, 在利用培养基中的肽类底物或降解细胞内蛋白起
重要作用, 对β-丙氨酰-L -组氨酸(包括肌肽) 有特异性, 另外还可能在其他细胞过程中充当结构成分[5]。对该蛋白进行重组表达、晶体生长和结构解析将有助于确定锌原子的配位形式, 了解锌蛋白酶的结构与功能的关系。本文报道对大肠杆菌肽酶D 的有关研究结果。
l 材料和方法1. 1 pepD 基因的克隆
1. 1. 1 大肠杆菌基因组DNA 的提取, 参照文献[6]1. 1. 2 pepD 基因的PCR 扩增和连接转化
根据基因序列设计上游和下游引物, 分别添加Nde I 和Xho I 酶切位点。上游引物:5′-ggaattccatat 2gtctgaactgtctcaa
-3′; 下游引物:5′-gatctc 2
μgagcttcgccggaatttctttc -3′。PCR 反应体系50L , 包括10×PCR 缓冲液,dNTP 各0. 2mm ol/L , 大肠杆菌基因组DNA
(100μg/m L ) 的3m L LB 培养基中,250rpm37℃过夜培养。将过夜培养物按1∶100比例扩大培养,250rpm ,37℃培养至OD 600值为0. 6左右, 加入lmm ol/L IPTG (终浓度) 诱导培养4小时, 将培养液转移到离心管中, 4℃, 4000rpm 离心10min 收集菌体细胞。用细胞裂解缓冲液(50mm ol/L Tris -HCl ,pH7. 5,200mm ol/L NaCl ) 重悬菌体沉淀, 超声破碎细胞, 工作3s , 间隔7s , 共99次。将细胞破碎液于4℃,15000rpm 离心30min , 收集上清。1. 3 重组PepD 蛋白的纯化
用5倍柱体积的去离子水冲洗镍柱。加一个柱体积的0. 1m ol/L NiS O 4, 使镍离子与柱子充分结合, 加5倍体积的去离子水洗去多余的镍离子, 加入3个柱体积以上的Binding Bu ffer (20mm ol/L Tris -HCl ,pH7. 5, 100mm ol/L NaCl ) 平衡。缓慢加入细胞破碎上清, 使样品和柱子能够充分作用, 加入5倍体积的Binding Bu ffer 冲洗柱子, 除去不结合的杂蛋白。然后加入7倍体积的Elution Bu ffer (20mm ol/L Tris -HCl ,pH7. 5,100mm ol/L NaCl ,25-200mm ol/L 咪唑) 洗脱蛋白, 收集洗脱液, 电泳检测, 合并目标蛋白。1. 4 重组PepD 蛋白的晶体生长
收稿日期:2004-
12-02; 修回日期:2005-04-05
23
用于结晶的蛋白样品浓度约为10mg/m L , 结晶方
μμ法为悬滴气相扩散法。2L 的悬液(1L 蛋白溶液与
μμ1L 平衡液混合) 对400L 平衡液作气相扩散。先用Crystal Screen kit I 和Ⅱ分别在18℃和4℃下初筛结晶条件, 再以各种不同的沉淀剂浓度梯度和缓冲液pH 梯度及不同添加剂进行条件优化。2 结果
2. 1 pepD 基因的克隆和重组表达
克隆的大肠杆菌pepD 全长1455bp , 编码485个氨基酸的多肽。根据其一级序列分析计算, 其pI 和分子量分别为5. 2和53kD 。该基因的PCR 扩增产物克隆于pET -22b 载体, 经酶切和测序鉴定后用于PepD 蛋白的重组表达。重组菌经IPTG 诱导后有明显的目的蛋白的表达, 表达蛋白存在于细胞破碎的上清中, 为可溶性蛋白(图1) 。表达蛋白经一步镍亲和层析柱纯化后获得电泳纯的蛋白(图2) 。每升重组表达大肠杆菌BL21可获得20mg 以上重组PepD 蛋白
。
图3 重组PepD 蛋白的动态光散射结果
2. 4 重组PepD 蛋白的晶体生长
在25%PEG 8000, 0. 1m ol/L Tris -HCl , pH8. 5,
100mm ol/L (NH 4) 2S O 4条件下, 生长温度为18℃时, 获得重组PepD 蛋白的晶体, 大小为1. 2×0. 7mm (图4)
。
图4 重组PepD 蛋白的晶体
3 讨论
图1 PepD
蛋白在大肠杆菌中的诱导表达
图2 纯化后的重组PepD 蛋白
2. 2 重组PepD 蛋白的锌含量
纯化后PepD 蛋白溶液经过冷冻干燥后, 其粉末样
品送中国科学技术大学结构分析中心进行原子吸收检
μ测。检测结果为每1g 蛋白中Zn 含量为1456. 7g , 相当
于每个PepD 蛋白分子中含有1个Zn 原子。2. 3 重组PepD 蛋白的动态光散射
动态光散射可以检测体系的均一性。一般情况下, 只有均一性高的蛋白才易于进行晶体生长。重组PepD 蛋白的动态光散射结果(图3) 表明, 该蛋白溶液为均一体系, 分子量为97kD , 因此PepD 蛋白是以二体形式存在于溶液中
。24
蛋白质结晶过程是溶液中处于随机状态的蛋白质分子转变成有规则排列状态的固体的有序化过程。一般认为, 在溶液达到过饱和时, 会形成一定大小的晶核, 分子不断地结合到形成的晶核上, 形成新的稳定的化学键(次级键) , 使整个体系能量降低而形成晶体。气相悬滴扩散法是根据蒸发扩散的原理, 使某种蛋白质结晶所需盐的浓度, 与略低于这种盐浓度的蛋白质溶液在一个封闭体系内蒸发扩散, 并最后达到过饱和而结晶[7]。要培养蛋白质晶体最重要的是分离纯化蛋白, 获得均一的样品, 一般为电泳纯。PepD 的S DS -PAGE 和动态光散射实验证明了该蛋白在经过镍亲和层析柱纯化后, 达到电泳纯, 均一性很好, 适于晶体生长。目前所得晶体可进一步进行条件优化, 获得更大晶体; 也可以直接用同步辐射光源收集晶体衍射数据。
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(下转18页)
4%、黄豆粉3%、氢氧化钙0. 3%、磷酸氢二钾0. 5%、硫酸镁0. 05%、pH 自然。AT01胞外多糖摇瓶最佳培养条件:起始pH6. 7、装液量100m L 和接种量为10%。
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Study on submerged fermentation and extraction conditions of AT 01,
a strain of Acremonium terricola extracellular polysaccharide
WU Qian -qian 1,2, LI Chun -yu 1,FAN Mei -zhen 1
(1. Anhui Agricultural University , Hefei 230036,China ;
2. Department of Biological and Environmental Engineering ,Hefei University ,Hefei 230022,China )
Abstract :The fermentation conditions of extracellular of ,a terricola Miller &al, were studied. The optimal com positions of media were 4%s ,0. 2(OH ) 2,0. 05%MgS O 4・7H 2O ,pH6. 7. The appropriate 10was 100ml/250ml.
K ey w ord :;liquid fermentation (上接24页)
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The expression and crystallization of PepD from E. coli
ZHANG Min 1,2,GE H ong -hua 1,2,X U Feng -feng 2
(1. School of Life Sciences ,Anhui University ,Hefei 230039,China ;2. School of Life Sciences ,USTC ,Hefei 230026,China ) Abstract :Aminoacyl-histidine dipeptidase from E. coli K 12(peptidase D ) is a kind of metalloprotease with a m olecular weight of 53K D and belongs to peptidase family M25. Primers were designed according to its gene sequence. The gene segment (1455bp ) was am plified by PCR and cloned into pET -22b vector. The recombinant plasmid was trans formed into com petent cell E. coli BL21for expression. The fusion protein was over-expressed at the tem perature of 37℃after induction of 1m M IPTG,and purified by a one-step Ni-chelating column chromatography method. The protein was probaly a dimmer and a polypeptide m olecule containing a Zn atom. The purified protein s olution was proved to be hom ogeneous by D LS (dynamic light scattering ) . Crystals of the protein were obtained using the hanging -drop vapour-diffusion method.
K ey w ords :aminoacyl -histidine dipeptidase ;expression ;crystal grow
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