细胞计数实验
细胞计数
朱德良
2015/4/19
1.清洗:PBS清洗培养皿或培养瓶上的细胞,除去杂质和死细胞x3次
2.消化:用胰蛋白酶T 消化,在倒置显微镜下观察消化情况,把握消化时机,吸弃胰酶,然后用培养液吹打下消化的细胞(实在不行就完全彻底消化,离心收集)。3.收集:把吹下细胞转入15ml 离心管,用移液器充分混合细胞。4.(稀释:)若浓度太高,不好计数可稀释,可从离心管取100ul 细胞液x10倍稀释至1ml 于EP 管中充分混匀。若细胞浓度差不多的话也可不稀释。
5.加样:先擦洗,晾干计数板,将盖玻片放在计数板正确位置上,后用移液抢吸出10ul 从盖玻片边缘的中央滴加,直至充满整个计数板和盖玻片的空隙。
6.计数:先低倍镜找到计数室,寻找到计数板大方网位置,转到高倍镜,使细胞和计数室的线条清晰,用按表计数7.细胞数计算公式及原理
e(个/ml)=N/V=(四个计数室的细胞总数)/(四个板的总体积)x稀释倍数
-34
=n/(4x1x1x0.1x10)x 稀释倍数=(n/4)x10x 稀释倍数
计数板原理:计数室的边长为1mm,中间平台下陷0.1mm,盖上盖片后计数室的容积为0.1mm3。根据在显微镜下观察到的细胞数目,换算成单位体积中细胞的数量。
3
8.种板和清洗:按实验需求进行稀释所需要的浓度种板,一般是5x10个/ml。用酒精棉球清洗计数细胞板
注意事项:细胞液一定要充分混匀,加液时不能有气泡,若细胞团按一个细胞算。
细胞在计数室线上,记上不计下,记左不记右。
蛋白制样和浓度测定
2015/4/24
①清洗:吸弃培养液,用PBS 清洗培养板上细胞(除去死细胞和杂质)
②裂解:吸弃PBS,准备冰盒和裂解液,整个裂解过程细胞板放在冰面上,用移液枪把配置好的裂解液PIRA 和蛋白抑制剂PMPF 混合液往细胞板孔边缘加入(VPIPA :VPMPF =100:1一般情况V PIPA =80ulV PMPF =1ul可用ep 管盛),5min后用100ul 枪头嘴折弯做成刮棒迅速刮培养板孔上细胞,再倾斜放入-20℃冰箱5min ,使细胞蛋白完全释放出来。转入EP 管放在-80℃3d 。③收集:把盛有蛋白样的EP 管从冰箱拿出插入冰盒每隔10minx12次在震动机震动后,低温超速离心4℃12000g /min取上清液200ul 于EP 管(一般有好几个样)
④BCA 测样浓度:⑴配置BCA 工作液。按V A :VB =50:1配实验所需量200ulx 酶标
液蛋白012
48121620? ? ? 量
⑶测吸光值:用酶标仪(mby2012)A562保存excel,用散点图及拟合曲线,然后校样算出各组样浓度
⑤配置buffer 染色稀释:5xbuffer +12%β硫基乙醇(因很粘稠要多配需量)。按V 样:Vbuffer =4:1加入蛋白样EP 管组,一般V 样=200ulV buffre =50ul⑥煮沸:用封口膜封住EP 管,放入沸水浴中30min 。
⑦上样:各组蛋白量是一定的。如40ug 1号----40/3.385=11.8x1.25=15ul2号----40/2.587=15.56x1.25=20ul3号----40/4.242=9.4x1.25=12ul