生物技术实训总结

微生物代谢产物制备与鉴定实训总结

实训目的

1、了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常用的生理生化反应的测定方法。

2、通过不同细菌对不同含碳、含氮化合物分解利用情况，了解细菌碳、氮代谢类型的多样性。

3、了解细菌在培养基中的生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义。 4、学习各种接种技术。

实训时间

2015年12月14日—2015年12月21日

实训项目

柠檬酸盐实验 糖发酵试验 吲哚实验

淀粉水解实验 硫化氢实验 甲基红实验

乙酰甲基甲醇实验 实验器材

实验原理

各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物存在差别。以此用生理生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物， 从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生理生化反应。

实验器材

1 菌种

大肠杆菌、普通变形杆菌、枯草杆菌、产气肠杆菌 2 培养基

淀粉培养基、蛋白胨培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、柠檬酸铵半固体培养基、葡萄糖发酵管和乳糖发酵管各3支。 3 溶液和试剂

卢戈氏碘液、甲基红试剂、40% KOH溶液、 萘酚，乙醚和吲哚试剂 4 仪器和其他用品

接种针、接种环、涂布棒、酒精灯、试管、锥形瓶、烧杯、量筒、平皿

试剂及培养基配置

（一）试剂 （1）V ．P ．试剂

1．5%α-萘酚无水酒精溶液 ：α-萘酚 5g 、无水乙醇 100ml 2．40%KOH溶液 ：KOH 40g 、蒸馏水 100ml （2）甲基红试剂

甲基红0.1g 、95%乙醇760ml 、蒸馏水100ml （3）吲哚试剂

对二甲基氨基苯甲醇8g 、95%乙醇760ml 、浓HCL 160ml （二）培养基

（1）葡萄糖蛋白胨水培养基——用于乙酰甲基甲醇（V.P ）和甲基红（M.R ）试验

配方：蛋白胨5g 、葡萄糖5g 、K2HPO4 2g、蒸馏水1000ml ，pH 7.2，115℃湿热灭菌20min

（2）蛋白胨水培养基——用于吲哚试验

配方：蛋白胨10g 、NaCl 5g 、蒸馏水1000ml ，pH 7.2-7.4，121℃湿热灭菌20min （3）糖发酵培养基——用于细菌糖发酵试验

配方：蛋白胨0.2g 、NaCl 0.5g、K2HPO4 0.02g、水100ml 、溴麝香草酚蓝（1%水溶液）0.3ml 、糖类1g 、蒸馏水1000ml ，115℃湿热灭菌20min

制法：分别称取蛋白胨和NaCl 溶于热水中，调pH 至7.4，再加入溴麝香草酚蓝（先用少量95%乙醇溶解后，再加水配成1%水溶液），加入糖类（葡萄糖、蔗糖等），分装试管，装量4-5cm 高，并倒放入一杜氏小管（管口向下，管内充满培养液），灭菌时注意延长煮沸时间，尽量把冷空气排尽以使杜氏小管内不残存气泡。

（4）淀粉培养基——用于淀粉水解试验

配方：蛋白胨10g 、NaCl 5g 、牛肉膏5g 、可溶性淀粉2g 、琼脂20g 、蒸馏水1000ml ，121℃湿热灭菌20min

（5）柠檬酸铁铵半固体培养基——用于硫化氢生成试验

配方：蛋白胨20g 、氯化钠5g 、柠檬酸铁铵0.5g 、硫代硫酸钠0.5g 、琼脂5-8g 、蒸馏水1000ml ，pH 7.2，121℃湿热灭菌20min （6）柠檬酸盐培养基

配方：硫酸二氢铵1g 、磷酸氢二钾1g 、氯化钠5g 硫酸镁0.2g 、柠檬酸钠2g 、琼脂15-20g 、蒸馏水1000ml 、1%溴麝香草酚蓝乙醇液10ml

制法：上述成分加热溶解后，调pH6.8，加入指示剂，摇匀，用脱脂棉过滤，制成后为黄绿色，分装试管，121℃灭菌20min 后制成斜面。

实验一：淀粉水解实验

一、目的要求

1、检测细菌能否产生淀粉酶和利用淀粉的能力。 2、学习点接法接种。 二、实验原理

有些细菌具有合成淀粉酶的能力，可以分泌胞外淀粉酶. 淀粉酶可以使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖, 淀粉水解后遇碘不再变蓝色。 三、仪器和材料

1、活材料:大肠杆菌, 枯草杆菌

2、培养基:淀粉培养基:牛肉膏蛋白胨培养基加0.2%的可溶性淀粉。 3、试剂:卢哥氏碘液。

4、实验用品：平皿, 接种环, 酒精灯, 试管, 接种针等。 四、实验步骤

准备淀粉培养基平板:将熔化后冷却至50℃左右的淀粉培养基倒入无菌平皿中, 待凝固后制成平板。

接种:用记号笔在平板底部划成两部分, 在每部分分别写上菌名, 用接种环取少量的待测菌, 点接在培养基表面的相对应部分的中心, 其中一个菌种应是枯草杆菌做对照菌。 培养:将接种后的平皿置于37℃恒温箱培养24h 。

六、结论分析

淀粉在酸的催化作用下，能发生水解；淀粉的水解过程：先生成分子量较小的糊精(淀粉不完全水解的产物) ，糊精继续水解生成麦芽糖，最终水解产物是葡萄糖。 培养基：将细菌接种在平板上，置37度温箱中培养24h ，加革兰氏碘液于菌落上，观察颜色变化，呈蓝色者为阴性，无蓝色为阳性。

实验二：吲哚实验

某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸而生成吲哚。吲哚与对二甲基氨苯甲醛结合，形成玫瑰吲哚，此为红色化合物，其反应变化如下：

一、目的要求

1. 学习鉴定细菌常用的生物化学试验原理和方法：吲哚试验。 2. 巩固无菌操作技术，学习无菌操作接种技术； 二、基本原理

有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚 (靛基质) 。吲哚本身没有颜色，不能直接看见，但当加入对二甲基氨基苯甲醛试剂时，该试剂与吲哚作用，形成红色的玫瑰吲哚。

流程：标记试管→接种→培养→观察→记录 三、实验步骤

（1）取蛋白胨水培养基试管四支，分别接种大肠杆菌，自己分离的大肠杆菌，枯草杆菌，留一支作空白对照，并在试管上注明菌名和组别，置37℃培养24小时。

（2）培养后取出，在培养液中先加入乙醚约1

毫

升（使呈明显的乙醚层），充分振荡，使吲哚溶于乙醚中，静置片刻，使乙醚层浮于培养基的上面，这时再沿管壁慢慢加入吲哚试剂5~10滴，观察有无红色出现。有红色环出现者为阳性，黄色者为阴性。 四、实验分析 右边图片是根据网络资料收集到的实验结果，经过对比，发现本组实验结果比较成功。 最终得结论：出有红色环出现者为阳性，黄色者为阴性。

实验三：糖发酵试验

一、实验目的

1、了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要作用。 二、实验原理

绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖的能力上有很大的差异，有些细菌能分解某种糖并产酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢、甲烷、二氧化碳等）；有些细菌只产酸不产气。例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌能分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；枯草芽孢杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖，普通变形杆菌能分解葡萄糖产酸、产气，但不能分解乳糖。

酸的产生可利用指示剂来断定。在配制培养基时预先加入溴甲酚紫[Ph5.2（黄色）-6.8（紫色）]，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体的产生可由发酵管中倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。 三、实验器材

大肠杆菌，普通变形杆菌；盛有葡萄糖发酵培养基的试管和乳糖发酵培养基的试管各3支（内装有倒置的杜氏小管），试管架，接种环等。 四、实验方法和步骤

1、编号：用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名。 2、接种：取盛有葡萄糖发酵培养基的试管3支，按编号1支接种大肠杆菌，另1支接种枯草芽孢杆菌，第3支不接种，作为对照。另取乳糖发酵培养基试管3支，同样1支接种大肠杆菌，1支接种枯草芽孢杆菌，第3支不接种，作为对照。 3．将上述已接种的葡萄糖和乳糖发酵试管和对照管置37℃温室中培养24小时。 4．观察结果，并记录。 五、实验分析

产气的判断：倒置的杜氏小管（有无气泡）

糖发酵试验结果：右侧为空白对照，左侧为发酵产酸阳性，但不产气，中间为产酸、产气，左侧试管为乳糖。右侧为葡萄糖有气泡产生。

注意事项：接种后应轻轻摇动试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡。否则会造成假象，得出错误答案。

实验四：甲基红实验

M.R 试验用于测定细菌分解葡萄糖产酸的程度。若所产生的酸是以降低pH 值到4.5或更低，此时加入的甲基红指示剂呈红色。甲基红指示剂的变色范围为pH4.2（红色）-6.3（黄色）。

一、试验原理：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可进

一步分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH 降至4.5以下，当加入甲基红试剂则呈红色，为甲基红试验阳性。若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质（如醇、酮、醚、气体和水等），则培养基的酸度仍在pH6.2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，是为阴性。

二、实验目的

甲基红试验是根据肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH 值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红这个原理进行的测验。 三、实验步骤

试验方法及结果：将纯种细菌接种葡萄糖蛋白胨水中，37℃培养3 d，以每5ml 培养基滴加5-6滴甲基红指示剂，呈鲜红色者为阳性，呈橘黄色者为弱阳性，阴性反应者不变色。 四、实验分析

鉴别大肠杆菌与产气肠杆菌，前者为阳性，后者为阴性。

实验五：柠檬酸盐实验

一、实验原理

柠檬酸盐培养基系一综合性培养基，其中柠檬酸钠为碳的唯一来源。而磷酸二氢铵是氮的唯一来源。有的细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳源，因此能在柠檬酸盐培养基上生长，并分解柠檬酸盐后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。此时培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌，在该培养基上不生长，培养基不变色。 二、实验目的

了解实验原理及鉴定中的意义及方法

三、实验器材

菌种：大肠杆菌、产气杆菌 培养基：柠檬酸盐斜面培养基 试验仪器：接种环、酒精灯、试管架 四、实验步骤

制法：将各物混合于蒸馏水内，加热溶解，校正pH7.0，混匀后分装试管，121℃20min 高压灭菌后摆成斜面。培养基呈淡绿色。培养基摆成斜面。将培养物划线接种。在最佳生长温度培养2d 。 五、实验分析

结果记录：产气杆菌、大肠杆菌均有菌产生；产气杆菌培养基呈深蓝色，为阳性。大肠杆菌培养基呈绿色，为阴性。

实验六：乙酰甲基甲醇实验

一、实验目的：了解鉴别不同肠杆菌科各菌属的乙酰甲基甲醇试验原理，并掌握其操作方法。

二、实验原理：某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧，氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V －P （+）反应。 三、实验材料： （1）菌种：大肠埃希氏菌、产气肠杆菌（2）培养基 葡萄糖蛋白胨液体培养基 四、实验步骤： （1）标记试管

取5支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌、枯草芽孢杆菌和空白对照。 （2）接种培养

以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中，空白对照管不接菌，置37℃恒温箱中，培养24～48h 。 （3）观察记录

取出以上试管，振荡2min 。另取5支空试管相应标记菌名，分别加入3～5ml 以上对应管中的培养液，再加入40％NaOH 溶液10～20滴，并用牙签挑入约0.5～1mg 微量肌酸，振荡试管，以使空气中的氧溶入，置37℃恒温箱中保温15～30min

后，若培养液呈红色，记录为V.P. 试验阳性反应（用“＋”表示）；若不呈红色，记录为V.P. 试验阴性反应（用“－”表示）。 五、实验分析

实验中，产气杆菌溶液为红色，为阳性；大肠杆菌溶液稍有浅红色，对照溶液为黄色，均为阴性。

实验七、硫化氢实验

一、实验原理：

某些菌能分解含硫的有机物，如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等产生硫化氢，硫化氢遇培养基中的铅盐、铁盐时，则形成黑色的硫化铅或硫化铁的沉淀物。 二、实验材料：

（1）菌种：大肠杆菌、产气肠杆菌 （2）培养基：柠檬酸铁铵半固体培养基 三、实验步骤：

（1）取H2S 试验用培养基四支（内含有柠檬酸铁铵），分别用穿刺法接种大肠杆菌，自己分离的大肠杆菌和变形杆菌，留一支空白，试管上注明菌名和组别，置37℃培养24小时。

（2）培养后取出观察，看有无黑色沉淀产生。 四、实验分析

变形杆菌与枯草杆菌相对比。变形杆菌呈现阳性

实验总结

1. 实训任务分配本次实训的时间为两周（10天），第一天我们在学校图书馆进行资料查阅，经过网络与书籍的查阅我们将七个实验的原理，试剂及培养基的配置都清晰的掌握。2-4天完成试剂和培养基的配置。5-9天按照培养时间进行接种，等待实验结果。10天进行整体总结汇报工作。

2. 小组分工：本组成员共有六人，组长一名、组员五人。郭鑫、王艳绯负责试剂配置、徐伟豪、刘旭堃负责仪器清洗、李爽、赵晓可负责培养基制备、接种工作。 3. 实验结果分析

4. 实验小结：

本次试验我们不仅根据书上的内容来完成实验，还查阅书籍、利用网络来更好的学习本次实训内容。

本次试验通过查阅资料也学到了很多知识，例如通过生理生化反应可以区分大肠杆菌和变形杆菌：由本次实验检测结果可知，区分大肠杆菌和变形杆菌可采用一下生理生化反应： 硫化氢产生试验：前者无沉淀（－），后者有黑色硫化铁沉淀（＋）。 还有在吲哚试验和硫化氢产生试验中细菌各分解哪种氨基酸；吲哚试验中细菌分解的是色氨酸；硫化氢产生试验中细菌分解的是含硫的氨基酸，如胱氨酸，半胱氨酸等。还有变形杆菌能分解葡萄糖产酸但不产气，若实验结果是阴性说明培养基未成功接种上变形杆菌。这次实验

重点是观察，而且要注意观察前的操作，细菌的培养需要耐心等待，培养完成后的检测观察更应注意，例如吲哚试验要注意不要晃动，因为产生的玫瑰色靛基质本来就不多，如果剧烈晃动使之扩散开来的话，就基本上看不见了；乙酰甲基甲醇实验的实验观察需要加热才能出现结果，因此需要等待。培养基的配制也认真比对用量进行称量。熬制培养基和熔化培养基时一定要有专人看管，以免烧糊或培养基溢出。接种的操作步骤也是严格按照老师的指导进行。操作时也会按照无菌操作要求去做，尽可能的防止有杂菌进入。本次七个项目的实验比较成功的完成。有小组成员之间的默契配合，也有老师的悉心指导。本次实训使我们的动手操作能力以及面对问题解决问题的能力有所提高，让我们都受益匪浅。

本次实训使我们学会并掌握了很多知识，也更加了解了细菌在微生物中的特点及变化。我们小组成员之间配合默契，以至于实验过程中出现的问题我们都能一起解决，小组分工明确，每个人都有自己的任务，实验才能如此顺利的完成，在实验过程中，我们失败过，我们利用课余时间再次重新实验，多次的实验使我们得到成功的结论。也非常感谢老师对我们的指导，使我们能快速掌握实验。