实验中细胞铺板的方法
于侵袭、迁移等试验的细胞计数及铺板
[实验步骤]
1、准备工作用
75% 的酒精擦拭双手,同时用酒精棉球擦拭超净台。2)将培养液、实验所需材料也放入超净台进行灭菌(血清、培养基除外)3)倒置显微镜下,观察细胞的状态,是否已经长满培养瓶,需要进行分瓶。
2、弃去培养基,用枪尽量去培养基。贴壁加入5mlPBS 液清洗一遍,四个方向晃动倒掉。
3、将0.25%胰酶600ul 加入培养皿内, 拍皿,上下左右铺匀,37°消化30分钟左右,随时观察,见到细胞泥沙状留下时,即消化完全.
4、加入4ml 的含5%血清的新鲜培养基,反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散,制成细胞悬液,然后装到15ml 离心管中。1000rpm,3min.
5、弃上清。用PBS 3ml 洗细胞,吹打或涡旋混匀,洗2次,离心1000rpm,3min. 弃上清。
6、配细胞稀释液(BSA 终浓度为0.1%)每种细胞需3ml 稀释液, 共6个样品,所以配20ml 稀释液(无血培20ml+10%BSA 200ul.)
7、细胞沉淀中加3ml 细胞稀释液,吹打混匀,即得稀释过的细胞悬液。
8、细胞计数板每孔加15ul 悬液。每个样品计数2次,算均值。(8个大格总数/8=数值*104)
9、根据铺板密度,计算稀释过的细胞悬液用量,剩余体积用细胞稀释液补。
普通的细胞计数及铺板(免疫荧光,WB 等不需定量)
[实验步骤]
1、准备工作用75% 的酒精擦拭双手,同时用酒精棉球擦拭超净台。2)将
培养液、实验所需材料也放入超净台进行灭菌(血清、培养基除外)3)倒置显
微镜下,观察细胞的状态,是否已经长满培养瓶,需要进行分瓶。
2、弃去培养基,用枪尽量去培养基。贴壁加入5mlPBS 液清洗一遍,四个方向晃动倒掉。
3、将0.25%胰酶600ul 加入培养皿内, 拍皿,上下左右铺匀,37°消化30分钟左右,随时观察,见到细胞泥沙状留下时,即消化完全.
4、加入4ml 的含血清的新鲜培养基,反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散,制成细胞悬液,然后装到15ml 离心管中。1000rpm,3min. 若细胞较多,则需稀释。
5、取上述1ml 细胞悬液,在加1ml 含血清的新鲜培养基,混匀。
6、细胞计数板每孔加15ul 悬液。每个样品对角线计数2次,算均值。
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、根据铺板密度,计算稀释过的细胞悬液用量,剩余体积用含血清的新鲜
培养基补。
注意:
1. 不健康的细胞质中有空泡,细胞内有颗粒样物质,细胞间空隙增大,变形,不规则,失去原有的特点。
2. 是否污染:传代或换液24-48 h 注意观察细胞是否被污染,污染的细胞培养液变浑浊,镜下可见有大量菌丝。如果细胞生长缓慢,生长特性改变,胞质内颗粒性物质增多,尽管培养液不变浑浊,考虑可能有支原体污染。污染的细胞立即从培养箱中取走,以免污染其它细胞。
3. 皿用20天左右,可更换。
4. 分清无血培、血培的用途。
二、Transwell 检测肿瘤细胞迁移实验
1. 在板孔(下室)中加入600 ul/well含有10%血清培养基作为引诱剂,小室底部接触培养基。
2. 轻轻的在细胞小室的上层加入140ul /well细胞悬液 (若细胞密度为5 x 105 cell/ml,则上室中共加入5 x 105 cell/ml x140ul=7 x 104cell) 。37 °C 孵育24小时(孵育时间根据实验调整,12-36小时)
3. 孵育结束,小心取出细胞小室,用棉签轻轻擦去上室液体。移到预先加入800 ul /well4%多聚甲醛或70%甲醇的下室中,室温固定30分钟。
4. 小心取出细胞小室,用吸干上室固定液。
(可4°保存,隔日再做。)800 ul/ wellPBS加入下室洗3次。室温晾干。
5. 800 ul/ well0. 1%结晶紫染色30min 。
6. 迅速将小室浸没到ddH2O 浸泡数次,去除多余的染料。吸去上室多余液体完全干燥小室。
7. 显微镜下观察结果,随机选取3个不同的视野拍照。
8.