2碱性磷酸酶活性520

ChineseJournalofPathophysiology2012，28（8）：1455－1460·1455·

［文章编号］1000－4718（2012）08－1455－06

木通皂苷D通过丝裂原活化蛋白激酶信号通路

*

促进大鼠骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞

1222222

张云辉△，刘成成，祝爱珍，陈小宇，刘革修，何冬梅，谭广销

2

（暨南大学1附属第一医院校门诊部，医学院血液病研究所，广东广州510632）

［摘要］目的：探讨木通皂苷D（ASD）是否促进大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化为成骨细胞及其机

制。方法：分离培养大鼠BMSCs；观察ASD对其向成骨细胞分化的影响以及p38丝裂原激活蛋白激酶（p38MAPK）抑制剂SB203580和细胞外信号调节激酶（ERK）抑制剂PD098059的干预作用；检测BMSCs分化过程中碱性磷酸酶（ALP）活性和骨钙素（OC）含量；实时荧光定量PCR检测护骨素（OPG）和核因子κB受体活化因子配体（RANKL）mRNA的表达；Westernblotting法检测p38MAPK和ERK活性水平。结果：ASD处理后第9d，成骨性分RANKLmRNA的表达量明显降低，同时显著提高BMSCs分化为成骨细胞化标志物OPGmRNA表达量明显增高，

的ALP活性和OC的表达，而且p38MAPK和ERK活性也显著增加。SB203580和PD098059则显著抑制ASD的成骨作用。结论：ASD在体外具有促进大鼠BMSCs向成骨细胞分化的作用，这一作用与MAPK途径的p38MAPK和ERK蛋白有关。

［关键词］木通皂苷D；间充质干细胞；成骨细胞；分化；信号通路［中图分类号］R332

［文献标志码］A

doi：10．3969/j．issn．1000－4718．2012．08．021

AkebiasaponinDpromotesdifferentiationofbonemarrowmesenchymal

stemcellsintoosteoblaststhroughMAPKsignalingpathways

ZHANGYun－hui1，LIUCheng－cheng2，ZHUAi－zhen2，CHENXiao－yu2，LIUGe－xiu2，HEDong－mei2，TANGuang－xiao2

2

（1CampusClinic，theFirstAffiliatedHospital，InstituteofHematology，SchoolofMedicine，JinanUniversity，Guangzhou

510632，China．E－mail：z001yh@163．com）

［ABSTRACT］AIM：ToexploretheroleofAkebiasaponinD（ASD）inthedifferentiationofratbonemarrow－derivedmesenchymalstemcells（BMSCs）intoosteoblasts．METHODS：TheratBMSCswereculturedusingroutinemethods．TheeffectsofASDonthedifferentiationofMSCsintoosteoblastswereobserved．Thep38mitogen－activatedproteinkinase（p38MAPK）inhibitorSB203580andextracellularsignal－regulatedkinase（ERK）inhibitorPD098059wereusedtoevaluatethemechanisms．Theactivityofalkalinephosphate（ALP）andcontentofosteocalcin（OC）wereas-sayedduringdifferentiation．ThemRNAexpressionofosteoprotegerin（OPG）andreceptoractivatorofnuclearfactor－κBligand（RANKL）wasdeterminedbyreal－timefluorescencequantitativePCR．Theactivityofp38MAPKandERKwasmeasuredbyWesternblotting．RESULTS：SixdaysaftertreatmentwithASD，themRNAexpressionofOPGsignificantlyincreased，whilethemRNAlevelofRANKLsignificantlydecreasedininducedcells．ASDincreasedtheactivityofALPandthecontentofOC．Moreover，ASDenhancedtheactivityofbothp38MAPKandERK，whichwasinhibitedbySB203580andPD098059．SB203580andPD098059alsoinhibitedthepositiveroleofASDinthedifferentiationofMSCsintoosteoblasts．CONCLUSION：AkebiasaponinDsignificantlyenhancesdifferentiationofratBMSCsintoosteoblastsinvitro，whichmaybemediatedbythep38MAPKandERKsignalingpathways．

［KEYWORDS］AkebiasaponinD；Mesenchymalstemcells；Osteoblast；Differentiation；Signalingpathway

骨髓间充质干细胞（bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs）亦称骨髓基质干细胞（bonemar-

［收稿日期］2012－04－09［修回日期］2012－06－13

*［基金项目］国家自然科学基金资助项目（No．30670902）△通讯作者Tel：020－85225658－809；E－mail：z001yh@163．com

·1456·

rowstromalcells，BMSCs），主要存在于机体骨髓腔

［1－3］

。其向中，具有干细胞特性，具有多向分化能力液以去除未贴壁细胞和各种杂质，加入5mL新鲜完

全培养液。此后每隔2～3d换液1次，倒置相差显

骨折修复和骨质疏松微镜下观察细胞生长状况，成骨分化特性是骨组织工程、直至细胞接近80%汇合

等研究的理论基础。木通皂苷D（AkebiasaponinD，时进行传代。此后每隔3～4d传代1次。取第4代ASD）是续断、木通药材的主要活性成分，又称川续细胞进行MSCs鉴定：成骨分化采用茜素红染色、成

［4］断皂苷IV，具有明确的药理活性，主要用于制备防脂分化细胞采用油红O染色、流式细胞术检测表面治骨质疏松和/或促进骨愈合的药物。有研究表明，标记CD44和CD45。ASD可促进成骨细胞增殖、分化，提高成骨细胞的活2．2ASD对BMSCs成骨分化的影响取第4代性和数量，促进基质钙化、骨痂生长，从而防止骨质已鉴定的BMSCs为研究对象，根据不同实验需要将

疏松、促进骨折的愈合

［5］

。目前研究表明，骨髓间充

质干细胞向成骨细胞定向分化，主要通过细胞外信号调节激酶1/2（extracellularsignal－regulatedkinase1/2，ERK1/2）和p38丝裂原激活蛋白激酶（p38mi-togen－activatedproteinkinase，p38MAPK）信号通路

细胞种植于培养皿或培养板中，加入成骨诱导液（含

10%胎牛血清、1×105U/L青霉素及100mg/L链霉10－8mol/L地塞米松、10mmol/Lβ－甘油磷酸素、

50mg/L抗坏血酸的DMEM低糖培养基）培养。钠、

观察不同浓度的ASD对BMSCs成骨分化的影响：实

A组：空白对照组，调节成骨细胞特异性转录因子Runx2的转录活性，验分6组，正常培养MSCs；B组：

Runx2则调节下游成骨性标志物的表达，例如护骨素实验对照组，成骨诱导分化MSCs；C组：成骨诱导液（osteoprotegerin，OPG）、核因子κB受体活化因子配体（receptoractivatorofnuclearfactor－kappaBlig-培养+ASD（0．1μmol/L）；D组：成骨诱导液培养+ASD（1．0μmol/L）；E组：成骨诱导液培养+ASD（10μmol/L）；F组：成骨诱导液培养+ASD（1．0μmol/L）+SB203580（20μmol/L）+PD098059（50μmol/L）。1．0μmol/LASD是根据预实验分析得出的实验适合浓度。

2．3ALP活性的测定

取已鉴定的BMSCs，以1×

108/L的密度接种于96孔板，每孔100μL，设5个复6、9和12d测定孔。各组于成骨性诱导培养第3、ALP活性，检测时将细胞洗涤后以0.2%TritonX－100裂解液及反复冻融法充分裂解，裂解液经低温离

取上清50μL，按试剂心机12000×g离心10min，

盒说明书进行操作，于酶标仪520nm波长处测定

ALP值。ALP活性以mmol·L－1·min－1·（gpro-表示。

2．4采用ELISA法检测骨钙素（osteocalcin，OC）的含量成骨诱导培养后每3d换液1次，每次换液

6、于－20℃保存，收集第3、时留取1mL旧培养液，tein）

－1

［6－9］

and，RANKL）等，。本研促进MSCs的成骨分化

究观察ASD是否促进大鼠骨髓间充质干细胞向成骨

细胞分化及其对ERK和p38MAPK活性的影响。

材

1

料和方法

材料

4周龄雄性SD大鼠购自中山大学实验动物中心；DMEM培养基、胎牛血清和胰蛋白酶购自Gibco；青霉素和链霉素购自华北制药；细胞裂解液、地塞米松、β－甘油磷酸钠和DMSO购自Sigma；SB203580

和PD098059购自Gibco；碱性磷酸酶（alkalinephos-phatase，ALP）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；细胞茜素红钙染色试剂盒购自上海杰美基因

p－ERK1/2、p38和p－p38医药有限公司；ERK1/2、抗体购自SantaCruz。

2方法2．1

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养按照文9和12d各组的样品，采用ELISA法检测骨钙素的［9］献，取4周龄雄性SD大鼠利用颈椎脱臼法处死，分泌量，以μg/L表示，具体操作步骤按试剂盒说明然后用75%乙醇浸泡5min，在无菌条件下分离出两书进行。侧股骨及胫骨，剔除干净表面附着的肌肉、筋膜等组2．5成骨性分化基因表达收集第12d各组的细织，剪去股骨近端和胫骨远端，充分暴露骨髓腔，用胞，用Trizol试剂按照常规方法抽提总RNA，采用DMEM完全培养基（含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素及100mg/L链霉素）反复冲洗骨髓腔，直至

A260/A280比值来确定总RNA的质量，并用2%琼脂糖

电泳检测其完整性。应用随机引物和反转录酶试剂骨髓腔发白，收集细胞转移至15mL的离心管中，盒反转录合成cDNA第1链，按常规方法进行。使1000r/min离心8min，弃上清，混成细胞悬液，约2用SYBRPremixExTaqTMReal－timePCR试剂盒配×106个细胞接种于25cm2培养瓶中，标记为原代P0，5%CO2的培养箱中培养。24h后换置于37℃、

制20μLPCR反应体系，采用实时荧光定量PCR法

RANKLmRNA表达情检测成骨性基因OPGmRNA、

·1457·

况。反应条件为：荧光定量PCR93℃3min，然后93℃1min，55℃1min，72℃1min，共40个循环。以目的基因扩增量/内参照（β－actin）基因扩增量表示所要检测基因的表达量。OPG/RANKLmRNA的

－Ct

相对表达量以公式2Δ表示，其中ΔCt=Ct（OPG/RANKL）－Ct（β－actin）。实时定量PCR引物及探针：OPG：sensestrand（5'－3'）CGGCACATTGGA-

CATGCTAA；anti－sensestrand（5'－3'）TCCCGGTA-AGCTTTCCATCA；probe（5'－3'）FAM－TCACCTTC-GAGCAGCTTCGTAGC－TAMRA。RANKL：sensestrand（5'－3'）CGATGGTGGATGGCTCATG；anti－sensestrand（5'－3'）TGAGCAAAAGGCTGAGCTTCA；probe（5'－3'）FAM－TTAGATCTGGCCAAGAGGAG-CAAGC－TAMRA。β－actin：sensestrand（5'－3'）GCGCGGCTACAGCTTCA；anti－sensestrand（5'－3'）TCTCCTTAATGTCACGCACGAT；probe（5'－3'）FAM－CACCACGGCCGAGCGGGA－TAMRA。2．6

图1

Figure1．TheBMSCsisolatedfromratbonemarrow（×200）．

A：theprimarycells；B：thefourthgenerationcells；C：oilredOstainingafteradipogenicinductionofdiffer-entiation；D：alizarinredstainingafterosteogenicin-ductionofdifferentiation．分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞

Westernblotting检测ERK和p38MAPK的表2ASD对BMSCsALP活性影响

6、9和12d均常规成骨诱导分化的细胞在第3、达及活性细胞处理48h后，用预冷的PBS洗2遍，

且逐渐增加，其活性与正常MSCs相比差4℃裂解30min，12000r/min离心表达ALP，加入细胞裂解液，

10min，取上清液，用BCA蛋白质定量试剂盒进行蛋异显著（P＜0．01）；低剂量ASD对细胞成骨分化则转移白定量。50μg总蛋白经SDS－PAGE分离后，

50g/L脱脂牛奶常温下封闭1h，用到PVDF膜上，

p38（1∶1000）、p－ERK1/2Ⅰ抗ERK1/2（1∶1000）、

（1∶1000）、p－p38（1∶1000）、β－actin（1∶5000）分

用TBST洗3次，每次10min，加入别4℃孵育过夜，

Ⅱ抗（1∶2500）孵育1．5h，再用TBST洗3次，每次

10min。将膜用发光试剂ECL显色，暗室曝光，凝胶成像系统分析结果。3统计学处理

6、9和12dALP活性与常规成作用不明显，在第3、

骨分化相比无显著差异（P＞0．05）；中、高剂量ASD6、9和12dALP活则促进MSCs成骨分化，在第3、

性与常规成骨分化相比差异显著（P＜0．01），中、高剂量ASD之间无显著差异（P＞0．05）；p38MAPK抑制剂SB203580（20μmol/L）和ERK抑制剂PD098059（50μmol/L）则抑制MSCs成骨分化，第3、6、9和12dALP活性与其它成骨分化组相比差异显著（P＜0．01）。

3ASD对BMSCs诱导分化过程中OC分泌的影

A组在第3、6、9和12d仅有微量OC生成；B组

±s）表示，数据以均数±标准差（x珋采用SPSS

13．0软件处理数据，组间比较采用单因素方差分析，响以P＜0．05为差异有统计学意义。

结

1

果

6、9和12dOC含量与A组相比差异显著（P在第3、

＜0．01）；D组在第3、6、9和12dOC含量明显增多，6、9、与B组相比差异显著（P＜0．01）；F组在第3、12dOC含量明显降低，D组相比差异显著（P与B、＜0．01），见图1。这说明1．0μmol/LASD对MSCs成骨分化具有促进作用。

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养骨髓细胞接种24h后，大部分细胞仍然悬浮，少

4ASD对BMSCs诱导分化过程中OPG与分离纯化骨髓间充质干细胞，第3代细胞形态单一，

RANKL表达的影响

呈梭形，可见集落形成，细胞增生活跃。第4代细胞

正常培养的MSCs几乎不表达OPG和RANKL

进行成骨成脂分化鉴定显示可以分化为成骨细胞和

mRNA，成骨诱导分化培养的细胞在第9d表达了一

脂肪细胞，见图1；流式细胞术检测CD44表达率为

定量的OPGmRNA和RANKLmRNA，两者比值为

93.50%，CD45表达率为0．21%

。

1.52±0．45；1．0μmol/LASD则可以进一步促进其

2～3d后量细胞贴壁生长、呈梭形，细胞生长缓慢，

7d左右达融合。通过传代、常规贴壁法增殖加快，

·1458·

OPGmRNA的表达，两者比值增加为3.87±1.20，与实验对照组相比差别有统计学意义（P＜0.05）；而SB203580（20μmol/L）和PD098059（50μmol/L）则

表1

protein）GroupABCDEF

－1

可显著抑制OPG的表达，两者比值增加为1.13±0.32，D组相比差别有统计学意义（P＜分别与B、0.05），见图2。

ASD对BMSCs成骨分化过程中碱性磷酸酶活性的影响

Table1．EffectsofAkebiasaponinD（ASD）onALPactivityofBMSCsduringdifferentiationtoosteoblasts［mmol·L－1·min－1·（g

．x±s．n=5］珋

3d0．22±0．20

＊

1．99±0．21＊

6d0．23±0．19

＊

2．63±0．20＊

9d0．23±0．22

＊

3．19±0．21＊

12d0．23±0．14

＊

3．01±0．25＊

2．02±0．112．62±0．23##2．53±0．23##1．45±0．21△△

2．69±0．233．29±0．24##3．15±0．24##1．43±0．22△△

3．20±0．263．90±0．26##3．69±0．26##1．39±0．21△△

3．08±0．153．54±0．25##3．43±0．25##1．42±0．21△△

A：normalMSCs；B：MSCsafterosteogenicinduction；C：MSCsafterosteogenicinductionandtreatedwithASD（0．1μmol/L）；D：MSCsafterosteogenicinductionandtreatedwithASD（1．0μmol/L）；E：MSCsafterosteogenicinductionandtreatedwithASD（10μmol/L）；F：MSCsafterosteogenicinduction，andtreatedwithASD（1．0μmol/L）+SB203580（20μmol/L）+PD098059（50

＊

P＜0．01vsAgroup；##P＜0．01vsBgroup；△△P＜0．01vsDorEgroup．μmol/L）．＊

表2

GroupABDF

3d

ASD对BMSCs成骨分化过程中骨钙素分泌的影响

6d3．63±0．80

＊

52．69±1．96＊

Table2．EffectsofASDonosteocalcinsecretionofBMSCscellsduringdifferentiationtoosteoblasts（μg·L－1．x±s．n=5）珋

9d3．74±0．81

＊

53．60±2．47＊

12d3．61±0．80

＊

53．08±2．05＊

3．69±0．79

＊

52．02±2．41＊

56．66±2．53##5．95±1．07△△

57．35±1．75##5．13±1．06△△

60．15±2．27##5．26±1．06△△

59．63±2．19##5．17±1．06△△

A：normalMSCs；B：MSCsafterosteogenicinduction；D：MSCsafterosteogenicinductionandtreatedwithASD（1．0μmol/L）；

＊

F：MSCsafterosteogenicinductionandtreatedwithASD（1．0μmol/L）+SB203580（20μmol/L）+PD098059（50μmol/L）．＊P＜

0．01vsAgroup；##P＜0．01vsBgroup；△△P＜0．01vsDgroup．

5

ASD对BMSCs向成骨细胞分化过程中ERK和p38MAPK的影响

成骨诱导分化过程中ASD（1．0μmol/L）处理的细胞不仅表达ERK和p38MAPK水平总量显著增

主要是由于成骨细胞形成不足和破种系统性骨病，

骨细胞吸收亢进所致的骨重建失衡。ALP是主要分布于细胞膜的钙结合转运蛋白，一种较为肯定的成骨细胞分化的早期指标，促进细胞成熟、钙化，它的

ALP活性越加，而且p－ERK1/2和p－p38MAPK也显著增加。表达和分泌会随着细胞的分化而增强，

SB203580（20μmol/L）和PD098059（50μmol/L）则强表明成骨细胞骨形成的状况越好。骨钙素是骨质可显著抑制p－ERK1/2和p－p38MAPK水平，见钙化必需的因子，维持骨组织的正常矿化。ALP和图3。骨钙素分别是成骨细胞早期和中期分化的标志物。

讨论

BMSCs用成骨诱导液加1μmol/LASD本研究发现，

培养，在细胞分化过程中碱性磷酸酶和骨钙素合成较对照组增多，说明ASD可促进BMSCs向成骨细

BMSCs在ASD作用后第胞分化。研究结果还显示，

9d，碱性磷酸酶和骨钙素合成最多，说明ASD在细

胞内起作用的时间需要9d左右。

MAPK是一系列丝氨酸/苏氨酸激酶，是介导细胞反应的重要信号系统，包括3个信号途径蛋白：ERK、c－Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK。它在细胞增们可激活多种转录因子来调控基因表达，

BMSCs具有多向分化潜能，能促进间充质组织的再生，如：骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱、脂肪及基质

等组织。自体骨髓间充质干细胞移植不会发生免疫BMSCs占骨髓有核细胞总排斥反应，但是在骨髓中，

数的0．001%～0．1%，含量极低。因此，体外培养获取骨髓间充质干细胞并诱导分化为成骨细胞，已经成为骨组织工程等的研究热点。

骨组织由细胞和骨基质组成。骨质疏松症是一

·1459·

Figure2．EffectsofASDonexpressionofOPG/RANKLduring

BMSCsdifferentiation．A：normalcontrol；B：osteogenicdifferentiation；Dosteogenicdifferentiation+ASD（1．0μmol/L）；F：osteogenicdifferentiation+ASD（1．0μmol/L）+SB203580（20μmol/L）+PD098059（50

＊

±s．n=5．＊P＜0．01vsAgroup；##P＜μmol/L）．x珋

0.01vsBgroup；△△P＜0．01vsDgroup．

图2BMSCs分化过程中ASD对BMSCsOPG/RANKL的

影响

殖、分化、运动及凋亡等多种生理过程中起着至关重

［10－12］

。要的作用

Suzuki等［13］研究发现，以MAPK细胞信号转导

MAPK通路主通路在成骨细胞的活化中最为重要，

要参与成骨细胞的分化，破骨细胞的形成和凋亡，并且在RANKL/RANK/OPG系统中具有主要的调控作用，是骨质疏松症发病的重要细胞信号途径。

Giner等［14］研究表明，成骨细胞能分泌OPG和RANKL，具有调节破骨细胞分化、发育的作用，其与

RANK破骨细胞上的RANK形成了一个骨调节轴，

RANK介导的信号是破骨细是RANKL的唯一受体，

活化的一道关键闸门。OPG抑制骨吸收功胞分化、

其中能通过与RANKL竞争性结合RANK来实现，

OPG扮演RANKL的诱饵性受体角色。RANKL与RANK结合后启动RANKL信号转导，OPG则与RANKL竞争性结合RANK，RANKL/OPG浓度比决

RANKL、RANK成熟及功能。因此，定破骨细胞分化、

和OPG形成了一个调节破骨细胞分化、成熟、功能的轴，这个调节轴也是影响破骨细胞分化、发育，调节其功能唯一的、最终的途径，

在多种骨质疏松中起重

Figure3．EffectsofASDonexpressionofp－ERK1/2andp－p38MAPKduringBMSCsdifferentiation．A：normalcontrol；B：osteo-genicdifferentiation；D：osteogenicdifferentiation+ASD（1．0μmol/L）；F：osteogenicdifferentiation+ASD（1．0μmol/

＊

L）+SB203580（20μmol/L）+PD098059（50μmol/L）．x±s．n=5．＊P＜0．01vsAgroup；##P＜0．01vsBgroup；△△P珋＜0．01vsDgroup．

图3ASD对BMSCs向成骨细胞分化过程中ERK和p38MAPK的影响

·1460·

要作用。本研究发现ASD可以上调BMSCsOPGmRNA表达，下调RANKLmRNA表达，使得OPG/RANKL比值升高；另外，本研究结果发现成骨诱导分化过程中川续断皂苷VI（1．0μmol/L）处理的细胞表达ERK和p38MAPK水平总量显著增加，说明ASD可能通过上调OPG/RANKL，使得ERK和p38MAPK通路蛋白增加，进而诱导BMSCs向成骨细胞分化。

ASD可以促进大鼠骨髓间充质干本研究提示，

细胞向成骨细胞分化，并可以上调OPG/RANKL，增加ERK和p38MAPK蛋白表达，对于探讨外伤、骨折后利用ASD治疗，促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化，促进骨愈合的机制具有重要意义。

［参

考

文

献］

inshockwave－promotedboneformationofsegmentalde-fectinrats［J］．Bone，2004，34（3）：466－477．

［7］DaiZ，LiY，QuarlesLD，etal．Resveratrolenhancespro-liferationandosteoblasticdifferentiationinhumanmesen-chymalstemcellsviaER－dependentERK1/2activation［J］．Phytomedicine，2007，14（12）：806－814．

［8］YangL，WangNL，CaiGP．MaohuosideApromotesoste-ogenesisofratmesenchymalstemcellsviaBMPandMAPKsignalingpathways［J］．MolCellBiochem，2011，358（1－2）：37－44．

［9］PengS，ZhouG，LukKD，etal．Strontiumpromotesos-teogenicdifferentiationofmesenchymalstemcellsthrough．CellPhysiolBio-theRas/MAPKsignalingpathway［J］chem，2009，23（1－3）：165－174．

［10］ChangL，KarinM．MammalinaMAPkinasesignalingcas-J］．Nature，2001，410（6824）：37－40．cades［

［11］HanYC，LiuLY，YanDX，etal．Correlationbetweenex-pressionofP38MAPK－signalinganduPAinbreastcancer［J］．ChinJClinOncol，2008，5（3）：161－164．

［12］TsubakiM，MatsuokaH，YamamotoC，etal．Theprotein

H7，inhibitstumorcellinvasionandkinaseCinhibitor，

metastasisinmousemelanomaviasuppressionofERK1/2［J］．ClinExpMetastasis，2007，24（6）：431－438．［13］SuzukiA，GuicheuxJ，PalmerG，etal．Evidenceforarole

ofp38MAPkinaseinexpressionofalkalinephosphataseduringosteoblasticcelldifferentiation［J］．Bone，2002，30（1）：91－98．

［14］GinerM，RiosMA，MontoyaMA，etal．RANKL/OPGin

primaryculturesofosteoblastsfrompost－menopausalwomen．DifferencesbetweenosteoporotichipfracturesandJ］．JSteroidBiochemMolBiol，2009，113osteoarthritis［（1－2）：46－51．

［1］PileggiA．Mesenchymalstemcellsforthetreatmentofdi-abetes［J］．Diabetes，2012，61（6）：1355－1356．［2］HanR，KanQ，SunY，etal．MiR－9promotestheneu-raldifferentiationofmousebonemarrowmesenchymalstem．Neuroscicellsviatargetingzincfingerprotein521［J］Lett，2012，515（2）：147－152．

［3］ZhangLL，LiuJJ，LiuF，etal．MiR－499inducescardi-acdifferentiationofratmesenchymalstemcellsthroughwnt/β－cateninsignalingpathway［J］．BiochemBiophysResCommun，2012，420（4）：875－881．

［4］杨中林．木通皂苷D在制备防治骨病药物中的应用：中

P］．国CN1493299A［

［5］程志安，吴燕峰，黄智清，等．续断对成骨细胞增殖、分

．中医正骨，2004，16化、凋亡和细胞周期的影响［J］（12）：1－3．

［6］ChenYJ，KuoYR，YangKD，etal．Activationofextra-cellularsignal－regulatedkinase（ERK）andp38kinase