2010药材显微鉴别法操作规程

药材显微鉴别法操作规程

1 适用范围：适用于药材显微鉴别。

2 职责

检验员：严格按操作规程进行检验。

QC 主任：监督检查执行情况。

3 定义

显微鉴别系指用显微镜对药材（饮片）切片、粉末、解离组织或表面制片及含药材粉末的制剂中药材的组织、细胞或内含物等特征进行鉴别的一种方法。鉴别时选择有代表性的供试品，根据各品种鉴别项的规定制片。制剂根据不同剂型适当处理后制片。此法适用于： ·药材性状鉴别特征不明显或外形相似而组织构造不同；

·药材呈粉末状或已破碎，不易辨认或区分；

·凡含药材粉末的制剂；

·用显微化学方法确定药材中有效成分在组织中的分布情况及其特征。

4 在进行显微鉴别时，首先要将样品制成适用于镜检的标本。对于完整的药材可制成各种切面的切片；对于粉末药材（包括丸、散等成方制剂）可直接装片或作适当处理后装片。 药材切片标本的制作方法较多。在药材鉴定的研究工作中往往将其制成石蜡切片（永久切片），因制在石蜡切片外形较完整，厚薄均匀，且可制得连续切片，既便于观察，又能长期保存。但由于制片技术复杂，费时太多，不适用于日常检验。所以在中药鉴定工作中经常采

用徒手切片或滑走切片法制片；为观察叶类、花类及全草类药材的叶片、花冠、萼片、苞片等的表皮组织及其附属物的特征，还需要将其制成表面装片；为清楚地观察比较硬的细胞组织，如导管、纤维、石细胞等的形态，往往还要进行“组织解离”后装片；观察花粉、孢子等的形态特征或构造，需用花粉粒与孢子制片法制片；观察矿物药或较坚硬的动物类药材如珍珠、石决明及动物骨骼，可采用磨片法制片。这些镜检标本片一般都是在观察前临时制备，故统称为“临时制片技术”。

本规程以中国药典现行版和局颁、部颁标准收载品种的显微鉴别项目要求为主，故主要介绍与临时制片技术有关的仪器、用具、试液和操作方法等。

5 仪器与用具

5.1 仪器 生物光学显微镜（应配有目镜测微尺和载物台测微尺，最好具2.5×或4×物镜头和偏光装置）、显微摄影装置或显微描绘器、电脑联机装置及其图像处理软件、滑走切片机、小型粉碎机、台式离心机、医用超声仪等。

5.2 用具

5.2.1 放大镜、刀片、解剖刀、镊子（包括粗镊及眼科弯镊与直镊）、剪（眼科剪与手术剪）、解剖针等。

5.2.2 载玻片、盖玻片。

5.2.3 吸湿器（即玻璃干燥器改装成底部放入蒸馏水并加微量苯酚防霉，上部瓷板上置药材样品，利用潮气润湿药材样品）、培养皿或小烧杯（放切片用，切片后的处理无可在其中进行）、酒精灯、铁三角架、石棉网、滴瓶、试管，试管架、滴管、玻璃棒（粗与细）、乳钵、量筒等。

5.2.4 毛笔（从刀上刷取切片用）、铅笔（HB 、3H 或6H 铅笔绘图用）、带盖搪瓷盘（）、纱布、绸布、滤纸、火柴等。

6 试液

6.1 水合氯醛试液 此液为常用封藏液，也是透化剂。可使干缩的细胞膨胀而透明，并能溶解淀粉粒、树脂、蛋白质、叶绿素及挥发油等，加热后透化效果更为明显。

6.2 甘油醋酸试液（斯氏液） 此液为常用封藏液。专用于观察淀粉粒形态，可使淀粉粒保持原形，便于测量其大小。

6.3 甘油乙醇试液 此液为常用封藏液，也是软化剂。常用于保存植物性材料及临时切片，有软化组织的作用。

6.4 苏丹III 试液 此液可使木栓化、角质化细胞壁及脂肪油、挥发油、树脂等染成红色或淡红色。

6.5 钌红试液 此液可使黏液染成红色。本液应临用新制。

6.6 间苯三酚试液 此液与盐酸合用，可使木化细胞壁染成红色或紫红色。

6.7 典试液 此液可使淀粉粒染成蓝色或紫色；蛋白质或糊粉粒染成棕色或黄棕色。

6.8 硝铬酸试液 此液为常用的“植物组织解离液”。解离浸泡时间，按样品的质地不同而异。

6.9 a-萘酚试液 此液可使菊糖染成紫红色，并很快溶解。

6.10 硝酸汞试液 （米隆氏试液）此液可使糊粉粒染成砖红色。

6.11 氯化锌碘试液 此液用于检查木质化与纤维素细胞壁，前者显黄棕色，后者显蓝色或紫色。

以上水合氯醛等试液，均应符合（中国药典2005年版一部附录XV B规定）规定。 7 制片

7.1 横切片或纵切片

● 选取供试品欲观察部位，经软化处理后，用徒手或滑走切片法，切成10~20μm 的薄片，

必要时可包埋后切片。选取平整的薄片置载玻片上，根据观察对象的不同，滴加甘油醋酸试液、水合氯醛试液或其他试液1～2滴，盖上盖玻片。必要时滴加水合氯醛试液后，在洒精灯上加热透化，并滴加甘油乙醇试液或稀甘油，盖上盖玻片。

7.2 粉末制片：主要用于粉末状的药材观察

● 取药材干燥，用粉碎机粉碎后过四号筛，挑取粉末少许置载玻片上，滴加甘油醋酸试液、

水合氯醛试液或其他适宜的试液，盖上盖玻片。必要时，按上法加热透化。

7.3 表面制片：凡较厚或新鲜药材用上述方法不能使之透化或不便于整体装片。 ● 将供试品湿润软化后，剪取欲观察部位约4mm 2，一正一反置载玻片上，或撕取表皮，加适

宜的试液或加热透化后，盖上盖玻片。

7.4 解离组织片：适用于厚壁组织或输导组织等的单个细胞的显微观察。

● 将供试品切成长约5mm 、直径约2mm 的段或厚约1mm 的片，如供试品中薄壁组织占大部分，

木化组织少或分散存在，采用氢氧化钾法；如果供试品质地坚硬，木化组织较多或集成较大群束，采用硝铬酸法或氯酸钾法。

7.4.1 氢氧化钾法

将供试品置于试管中，加5%氢氧化钾溶液适量，加热至玻璃棒挤压能离散为止，倾去碱液，加水洗涤后，取出少量置载玻片上，用解剖针撕开，滴加稀甘油，盖上盖玻片。

7.4.2 硝铬酸法

置供试品于试管中，加硝铬酸试液适量，放置至用玻璃棒压能离散为止，倾去酸液，加水洗涤后，照氢氧化钾法操作装片。

7.4.3 氯酸钾法

置供试品于试管中，加硝酸溶液（1→2）及氯酸钾少量，缓缓加热，待产生的气泡渐少时，再及时加入氯酸钾少量，以维持气泡稳定地发生，至用玻璃棒挤压能离散为止，倾去酸液，加水洗涤后，照氢氧化钾法操作装片。

7.5 花粉与孢子制片

取花粉、花药（或小的花朵）、孢子或孢子囊群（干燥的供试品浸于冰醋酸中软化），用

玻璃棒研碎，经纱布过滤至离心管中，离心，取沉淀加新配制的醋酐与硫酸（9:1）的混合液1~3ml，置水浴上加热2~3分钟，离心，取沉淀，用水洗涤2次，取沉淀少量置载玻片上，滴加水合氯醛试液，盖上盖玻片，或加50%甘油与1%苯酚各1~2滴，用品红甘油胶[取明胶1g ，加水6ml ，浸泡至溶化，再加甘油7ml ，加热并轻轻搅拌至完全混匀，用纱布过滤至培养皿中，加碱性品红溶液（碱性品红0.1g ，加无水乙醇600ml 及樟油80ml ，溶解）适量，混匀，凝固后即得]封藏。

7.6 磨片制片

坚硬的动物、矿物类药，可采用磨片法制片。选取厚度约1～2mm 的供试材料，置粗磨石（或磨砂玻璃板）上，加适量水，用食指、中指夹住或压住材料，在磨石上往返磨砺，待两面磨平，且厚度约数百微米时，将材料移置细磨石上，加水，用软木塞压在材料上，往返磨砺至透明，用水冲洗，再用乙醇处理和甘油乙醇试液装片。

7.7 含药材粉末的制剂显微制片

按供试品不同剂型，散剂、胶囊剂（内容物为颗粒状，应研细），可直接取适量粉末；片剂取2～3片，水丸、糊丸、水蜜丸、锭剂等（包衣者除去包衣），取数丸或1～2锭，分别置乳钵中研成粉末，取适量粉末；蜜丸应将药丸切开，从切面由外至中央挑取适量样品或用水脱蜜后，吸取沉淀物少量。根据观察对象不同，分别按粉末制片法制片（1～5片）。

7.8 细胞壁性质的鉴别

7.8.1 木质化细胞壁：加间苯三酚试液1~2滴，稍放置，加盐酸1滴，因木质化程度不同，显红色或紫红色。

7.8.2 木栓化或角质化细胞壁：加苏丹Ⅲ试液，稍放置或微热，显橘红色至红色。

7.8.3 纤维素细胞壁：加氯化锌碘试液，或先加碘试液湿润后，稍放置，再加硫酸溶液（33→50）；显蓝色或紫色。

7.8.4 硅质化细胞壁：加硫酸无变化。

7.9 细胞内含物性质的鉴别

7.8.1 淀粉粒

7.8.1.1 加碘试液，显蓝色或紫色。

7.8.1.2 用甘油醋酸试液装片，置偏光显微镜下观察，未糊化的淀粉粒显偏光现象；已糊化的无偏光现象。

7.8.2 糊粉粒

7.8.2.1 加碘试液，显棕色或黄棕色。

7.8.2.2 加硝酸汞试液，显砖红色。材料中如含有多量脂肪油，宜先用乙醚或石油醚脱脂后进行试验。

7.8.3 脂肪油、挥发油、树脂

7.8.3.1 加苏丹Ⅲ试液，显橘红色、红色或紫红色。

7.8.3.2 加90%乙醇，脂肪油和树脂不溶解（蓖麻油及巴豆油例外），挥发油则溶解。

7.8.4 菊糖 加10%α-萘酚乙醇溶液，再加硫酸，显紫红色并溶解。

7.8.5 黏液：加钌红试液，显红色。

7.8.6 草酸钙结晶

7.8.6.1 加稀醋酸不溶解，加稀盐酸溶解而无气泡发生。

7.8.6.2 加硫酸溶液（1→2），逐渐溶解，片刻后析出针状硫酸钙结晶。

7.8.7 碳酸钙结晶（钟乳体）：加稀盐酸溶解，同时有气泡发生。

7.8.8 硅质：加硫酸不溶解。

细胞及细胞内含物性质的鉴别

7.9 显微测量

系指用目镜测微尺，在显微镜下测量细胞及细胞内含物等的大小。

7.9.1 目镜测微尺 放在目镜筒内的一种标尺，为一个直径18～20mm 的圆形玻璃片，中央刻有精确等距离的平行线刻度，常为50格或100格。

7.9.2 载物台测微尺 在特制的载玻片中央粘贴一刻有精细尺度的圆开玻片。通常将长1mm （或2mm ）精确等分成100（或200）小格，每1小格长10um ，用以标定目镜测微尺。

7.9.3 目镜测微尺的标定 用以确定使用同一显微镜及特定倍数的物镜、目镜和镜筒长度时，目镜测微尺上每一格所代表的长度。

取载物台测微尺置显微镜载物台上，在高倍物镜（或低倍物镜）下，将测微尺刻度移至

视野中央。将目镜测微尺（正面向上）放入目镜镜筒内，旋转目镜，并移动载物台测微尺，使目镜测微尺的“0“刻度线与载物台测微尺的某刻度线相重合，然后再找第二条重合刻度线，根据两条重合线间两种测微尺的小格数，计算出目镜测微尺每一小格在刻物镜条件下相当的长度（um ）。

当测定时要用不同的放大倍数时，应分别标定。

7.9.4 测量方法 将需测量的目的物显微 微片置显微镜载物台上，用目镜测微尺测量目的物的小格数，乘以上述每一小格的微米数，通常是在高倍镜下测量，但欲测量较长的目的物，如纤维、导管、非腺毛等的长度时，需在低倍镜下测量。记录最大值与最小值（um ），允许有少量数值略高或略低于规定。

8 注意事项

8.1 粉末制片时易产生气泡，可先加少量乙醇使其润湿或反复将盖玻片沿一侧轻抬，产生的气泡可用滤纸或针将其移出。

8.2 装片用的液体如易挥发，装片后立即观察。

8.3 用水合氯醛试液透化时，装片后手持一端保持水平，置小火焰上约1～2cm 处加热，缓缓左右移动使之微沸，见气泡逸处时离开火焰，待气泡停止逸处再放在小火上，并随时补充蒸发的试液，如此反复操作，直至粉末呈透明状为止，放冷后滴加甘油镜检。

8.4 显微鉴别法所用盖玻片和载玻片应洁净，新片要用洗液浸泡或用肥皂水煮半小时，用水冲洗，再用蒸馏水冲洗1～2次，置70～90%乙醇中，取出，烘干。

9 编制依据

《中国药典》2010年版一部

《中国药品检验标准操作规范》2010年版