活细胞硫化氢检测新方法_谢静
北京大学学报（医学版）
JOUＲNALOF PEKING UNIVEＲSITY（HEALTH SCIENCES ）
Vol．45No．3Jun．2013
·489·
·技术方法·
活细胞硫化氢检测新方法
谢
1，2静，曾
1
强，郑
2
扬，廖
222
锋，徐国恒，唐朝枢，耿
彬
2△
（1．中国人民解放军总医院国际医学中心，北京100853；2．北京大学基础医学院生理学与病理生理学系，北京100191）［摘
H 2S ）的简易方法。方法：在细胞培养板盖上方要］目的：建立测定活细胞释放微量硫化氢（hydrogen sulfide ，
细胞释放的硫化氢与滤膜上的醋酸锌反应产生硫化锌，采用亚甲基蓝分光光度法测定并计算细胞释放黏附滤膜，
的硫化氢的量。应用该方法分别检测了HepG2细胞和人脐静脉内皮细胞硫化氢的释放量。结果：HepG2细胞添加L-H 2S 释放量为（859．39ʃ 19．12）nmol /（min ·106cells ）；给予胱半胱氨酸以及辅酶磷酸吡哆醛后，继续培养12h ，propargylglycine ，PAG ）后，H 2S 产率下降到（341．34ʃ 105．90）nmol /硫醚-γ-裂解酶抑制剂炔丙基甘氨酸（DL-（min ·106cells ）；胱硫醚-H 2S 产率下降到（375．05ʃ 174．50）nmol /（min ·106cells ）；β-合酶抑制剂间羟胺处理后，
6
两种酶抑制剂联合使用后H 2S 释放量显著抑制，为（204．47ʃ 97．14）nmol /（min ·10cells ）。人脐静脉内皮细胞也
HUVEC 细胞H 2S 的释放量为（26．23ʃ 3．24）nmol /（min ·106cells ），可内源性产生H 2S ，约为HepG2细胞产量的1/30。台盼蓝检测细胞活性大于95%，细胞生长状态良好，表明该方法无细胞毒作用，细胞可根据实验需要继续培养。结论：滤膜吸附法简便易行、实用可靠，可应用于活细胞释放硫化氢的测定。［关键词］硫化氢；细胞；亚甲基蓝；胱硫醚β合酶；胱硫醚γ裂解酶［33中图分类号］Ｒ33-［文献标志码］A
［167X （2013）03-0489-04文章编号］1671-doi ：10．3969/j．issn．1671-167X．2013．03．029
A new methods for determining hydrogen sulfide release in cultured cells
2XIE Jing 1，，ZENG Qiang 1，ZHENG Yang 2，LIAO Feng 2，XU Guo-heng 2，TANG Chao-shu 2，GENG Bin 2△
（1．International Medical Center ，PLA General Hospital ，Beijing 100853，China ；2．Department of Physiology and Patho-physiology ，Peking University Health Science Center ，Beijing 100191，China ）
Objective ：To establish a simple method of measuring hydrogen sulfide （H 2S ）in cultured
living cells．Methods ：Filtration membrane was stuck on the lid of cell culture plate．H 2S released from cultured cells was trapped by zinc acetate to generate ZnS deposition．Then the ZnS trapped in the filtra-tion membrane was measured by methylene blue assay and the H 2S production from the living cells was counted according to the standard curve．This simple method was used to access the H 2S release in HepG2（high expression CBS and CSE ）and HUVEC （low expression CSE ）cell lines．Ｒesults：H 2S generation in cultured HepG2cells assayed using the present method was （859．39ʃ 19．12）nmol /（min ·106cells ）．PAG （CSE inhibitor ），HA （CBS inhibitor ）or the two-inhibitor （PAG +HA ）treat-ment significantly lowered H 2S release ，respectively ：（341．34ʃ 105．90）nmol /（min ·106cells ），（375．05ʃ 174．50）nmol /（min ·106cells ），and （204．47ʃ 97．14）nmol /（min ·106cells ）．The H 2S production of HUVEC was （26．23ʃ 3．24）nmol /（min ·106cells ）（about 1/30production of HepG2cell ）．Trypan blue assay showed that the cell viability was greater than 95%，suggesting that there was no cytotoxicity by using the present instrument．Conclusion ：The modified instrument in cell culture plate lid was feasible for detection of hydrogen sulfide release in living cells．
lyase ；Cystathionine KEY WOＲDSHydrogen sulfide ；Cells ；Methylene blue ；Cystathionine gamma-beta-synthase
ABSTＲACT
H 2S ）是继NO 内源性硫化氢（hydrogen sulfide ，
［1］
和CO 之后发现的又一种重要的气体信号分子，具有多种生物学效应，参与多系统、多种疾病的病［2］
理功能调节。内源性H 2S 在体内主要由3种酶
syn-催化产生：胱硫醚-β-合酶（cystathionine-β-
thase ，CBS ）、胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyase ，CSE ）和巯基丙酮酸转硫酶（3-mercaptopyru-vate transsulphurase ，MPST ）［3］。应用离体培养细胞灵敏、准确地来进行观察是医学研究重要的手段，
测量在培养细胞H 2S 的释放量时十分关键，传统
“十二五”基金项目：国家自然科学基金（81170235）和国家科技支撑计划（2012BAI37B04）项目资助Supported by the National Natural Sci-ence Foundation of China （81170235）and the National Science and Technology Pillar Program during the 12th Five-Year Plan （2012BAI37B04）
s e-mail ，bingeng@hsc．pku．edu．cn △Corresponding author ’
4-258ʒ09ʒ42 网络出版地址：http ：//www．cnki．net /kcms/detail/11．4691．Ｒ．20130425．0809．002．html 网络出版时间：2013-
北京大学学报（医学版）
·490·
JOUＲNALOF PEKING UNIVEＲSITY（HEALTH SCIENCES ）
Vol．45No．3Jun．2013
测量细胞释放H ［4］
2S 主要采用收集培养上清或将H 2SO 4充分搅拌溶解，定容到100mL ，室温保存。
细胞匀浆裂解后［5］
按照测量组织的H 2S 方法检1．2．2步骤测。细胞释放出的H 2S 较少，在液体环境中仅有1．2．2．1
制备滤膜吸附装置将微孔滤膜用胶水
1/3处于游离状态，且由于易挥发的特性，细胞培
依次粘在培养板盖子内侧面（图1），紫外光下照射
养基中的H 2S 几乎难以检测到。按照测量组织的
30min 后使用。
H 2S 方法收集并裂解细胞所需的细胞数量很大，测定结果仅能提示细胞在药物处理或特殊修饰后内
源性H 2S 生成酶的活性，
不能反映出细胞在建立模型、药物刺激过程中内源性硫化氢的真实释放
量的变化。
Kartha 等［6］为培养细胞设计了琼脂吸附装置，但此法仅适于培养瓶中细胞释放H 2S 的测量，细胞用量大且不宜进行高通量测量。本实验方法在细胞培养板自制滤膜装置吸附细胞释放出的H 2S ，积累
一定时间后采用亚甲基蓝分光光度法［7］
进行检测。该方法材料易得、操作简便，能较好地反映细胞释放
的H 图1
滤膜吸附装置
2S 总量，可进行高通量测量、动态监测培养细
胞释放的H 细胞生长状态良好，同批细胞可Figure 1
The instrument of trapping
2S 量，继续用于后期的实验研究。1．2．2．2
实验分组及处理HepG2细胞中，将12
1材料与方法孔培养板分为4组，每组3孔。PBS 洗3次，每孔加入1mL 无血清DMEM 培养基，第1组给予反应底1．1材料
物2mmol /LL-Cys +0．5mmol /L5-磷酸吡哆醛1．1．1
实验所用细胞系
人肝癌细胞系HepG2细
（pyridoxal phosphate ，PLP ）；第2组给予L-Cys +胞和人脐静脉内皮细胞均购自美国ATCC 公司。
PLP +0．2mmol /L炔丙基甘氨酸（DL-propargylg-
1．1．2
实验仪器与药品紫外可见分光光度仪
lycine ，PAG ；CSE 抑制剂）；第3组给予L-Cys +（ΜV-5300PC 型）购自中国上海元析仪器有限公司；PLP +0．05mmol /L间羟胺（hydroxylamine ，HA ；CBS 2．4cm 微孔滤膜购自英国Whatman 公司；0．2μm 抑制剂）；第4组给予L-Cys +PLP +PAG +HA 。1%的滤器购自美国Millipore 公司；12孔细胞培养板购（质量分数）醋酸锌溶液过0．2μm 的滤器除菌后，自美国康宁公司；磷酸吡哆醛购自美国Amresco 公在每片滤膜上滴加500μL ，置于37ħ （体积分数），
司；L-半胱氨酸（L-cysteine ，L-Cys ）、炔丙基甘氨酸、
5%（体积分数）CO 2的孵箱内孵育1224h 。HUVEC 间羟胺和台盼蓝均购自美国Sigma 公司；醋酸锌和细胞置CO 2孵箱内孵育8h 。N ，N-二甲基对苯二胺盐酸盐购自中国上海试剂三1．2．2．3配制Na 2S 作标准曲线
HepG2细胞组需厂；硫酸铁铵、硫化钠和98%（质量分数）硫酸购自要配制浓度梯度为1000、
500、250、125和62．5中国国药集团化学试剂有限公司。μmol /L的Na 2S 溶液，各取0．5mL ，每管加入2．5
1．2方法
mL 去离子水，依次加入0．5mL 1%（质量分数）醋
1．2．1
缓冲液配制
［8］
酸锌、0．5mL 0．2%（质量分数）N ，N-二甲基对苯1．2．1．11%（质量分数）醋酸锌溶液称取1g 二胺溶液，再加入0．05mL 10%（质量分数）硫酸铁醋酸锌，加去离子水约80mL 充分搅拌溶解后定容铵溶液，室温静置20min 。调零管用去离子水代替到100mL ，密封室温保存。
Na 2S 溶液，于670nm 读取光密度（D ）值，所得直线1．2．1．20．2%（质量分数）N ，N-二甲基对苯二胺方程为Y =0．002X +0．093，
Ｒ2=0．99（图2A ）。溶液
称取0．2g 二甲基对苯二胺盐酸盐，加20mL HUVEC 细胞组需要配制浓度梯度为100、50、25和去离子水充分搅拌溶解，然后加20mL 98%H 2SO 4，
12．5μmol /L的Na 2S 溶液，于670nm 读取D 值，所最后定容到100mL ，密封避光室温保存。
得直线方程为Y =0．005X －0．025，Ｒ2=0．99（图1．2．1．310%（质量分数）硫酸铁铵溶液称取2B ）。10g 硫酸铁铵，加去离子水约80mL ，加0．2mL 浓
1．2．2．4
亚甲基蓝法测定细胞释放H 2S 量
将滤
珋ʃ s 表示，计量资料以x 两组之间采用t 检验，
P ＜0．05认为差异有统计学意义。2
结果
0．5mL 膜放入软管中，每管加入3mL 去离子水，
0．2%（质量分数）N ，N-二甲基对苯二胺溶液，再加入0．05mL 10%（质量分数）硫酸铁铵溶液，轻轻震荡软管，室温静置20min ，待其反应完全后于670nm 读取D 值。根据标准曲线计算出细胞H 2S 累积
6产量，结果以nmol /（min ·10cells ）表示
。
亚甲基蓝法测定HepG2细胞经不同处理所测
H 2S 产生率，对照组H 2S 生成率为（859．39ʃ 19．12）nmol /（min ·106cells ）；CBS 抑制剂HA 处理组H 2S 生成率为（375．05ʃ 174．50）nmol /（min ·106cells ）；CSE 抑制剂PAG 处理后H 2S 生成率为（341．34ʃ 105．90）nmol /（min ·106cells ）；HA +PAG 共处理组H 2S 生成率为（204．47ʃ 97．14）nmol /（min ·106cells ）（图3）。给予不同的H 2S 生成关键酶抑制剂均显著抑制了H 2S 的产生（P ＜0．01）。
应用该方法也检测HUVEC 细胞H 2S 生成率为（26．23ʃ 3．24）nmol /（min ·106cells ）。提示该方法可以用于检测细胞内H 2S 的生成率，而台盼蓝拒染法计算细胞存活率大于96%ʃ 2．3%，提示该方法处理基本不影响细胞活力。
A ，HepG2；B ，HUVEC．
图2Figure 2
亚甲基蓝分光光度法所测标准曲线The standard curve of methylene blue assay
1．2．2．5
细胞存活率采用台盼蓝拒染法，将各孔
PBS 制成悬液，细胞胰酶消化，取0．9mL 混匀的细胞悬液与0．4g /L台盼蓝0．1mL 混匀，染色2min
后，显微镜下用血细胞计数板计数，按公式计算细
#P ＜0．01，vs．control ；L-Cys ，L-cysteine ；PLP ，pyridoxal phosphate ；
PAG ，DL-propargylglycine ；HA ，hydroxylamine．
图3
内源性H 2S 产生关键酶的抑制剂对HepG2细胞释放H 2S 量的影响
Figure 3
The effect of CSE and /orCBS inhibitors on the H 2S generation in HepG2cells
胞存活率/%=（总细胞数－着色细胞数）/总细胞数ˑ 100。1．2．2．6
注意事项（1）滤膜应贴于板盖孔印正
中，周边比培养孔小1mm ；（2）1%（质量分数）醋酸锌需现用现配，均匀滴加于滤膜上，待浸透滤膜且无外溢后，轻轻将培养板盖子盖好；（3）滤膜长时间在液体中浸泡会有纤维在液体中悬浮，影响光密度读数，可3000r /min离心5min 后取上清读数。1．3
统计学分析
3
讨论
近年来大量研究证实内源性H 2S 作为一种新
型气体信号分子，在多种系统中有重要的生理作用。
CBS 和CSE 两种酶以L-在细胞内，半胱氨酸为底物
［9－10］
，以5-磷酸吡哆醛为辅酶催化产生H 2S 。依
据该酶学反应，产生的H 2S 释放后被醋酸锌吸收，随时间延长，达到检测浓度即可进行检测。细胞H 2S 的检测常用方法有：（1）收集细胞裂解后应用组织测定方法：用亚甲基蓝或敏感硫电极来进行检测，该方法需要细胞量大，而且只能处理细胞，检测过程中不能给予刺激，只反映处理后细胞内CBS 或CSE 的活性是否受到了影响，不能反映在刺激过
［12］
程中的变化；（2）在体细胞荧光染色：此方法在检测时必须洗涤细胞，虽然可以定位和定量分析，但处
［11］
H 2S 可与血清中蛋白质发生结合，产率高的细胞可换无血清培养基培养；低产率细胞可采用正常血清
1224h 后培养基中加入三氯乙酸，培养，使其终浓度达到8%10%，再吸附1h 左右，而细胞则可用细胞刮刮下重新用于蛋白分析等研究。
本研究表明，滤膜吸附装置成本低廉，简便易实用可靠，灵敏度强，稳定性好，能较好地反映细行，
胞释放的H 2S 总量。既可高通量测量，又能够根据实验对时间的需求动态监测培养细胞释放的H 2S 量，适合应用于在培养细胞的产H 2S 通路的相关研究及H 2S 供体和抑制剂的筛选。测量过程无需将细胞匀浆破碎，其测定原理为酶催化后滤膜上的化
不影响培养细胞的生长状态，同批细学和物理反应，
胞可继续用于细胞培养实验的后期细胞分子生物学
及病理学等方面的实验研究，保证了实验样本的前后一致性。
参考文献
［1］耿彬，杜军保，唐朝枢．内源性H 2S ———一种新的气体信号分
J ］．生理科学进展，2002，33（3）：255－258．子［
［2］Olson KＲ．Is hydrogen sulfide a circulating “gasotransmitter ”in
vertebrate blood ［J ］．Biochim Biophys Acta ，2009，1787（7）：856－863．
［3］Kamoun P．Endogenous production of hydrogen sulfide in mam-mals ［J ］．Amino Acids ，2004，26（3）：243－254．［4］Zhu YZ ，Wang ZJ ，Ho P ，et al．Hydrogen sulfide and its possible
roles in myocardial ischemia in experimental rats ［J ］．J Appl
2007，102（1）：261－268．Physiol ，
［5］Yang G ，Wu L ，Bryan S ，et al．Cystathionine gamma-lyase defi-ciency and overproliferation of smooth muscle cells ［J ］．Cardio-vasc Ｒes，2010，86（3）：487－495．
［6］Kartha ＲV，Zhou J ，Hovde LB ，et al．Enhanced detection of hy-drogen sulfide generated in cell culture using an agar trap method ［J ］．Anal Biochem ，2012，423（1）：102－108．
［7］Stipanuk MH ，Beck PW．Characterization of the enzymic capacity
for cysteine desulphhydration in liver and kidney of the rat ［J ］．Biochem J ，1982，206（2）：267－277．［8］Zheng Y ，Liao F ，Geng B ，et al．Modified methylene blue method
for measurement of hydrogen sulfide level in plasma ［J ］．Sheng Li Xue Bao ，2012，64（6）：681－686．［9］Wang Ｒ．Two ’s company ，three ’s a crowd ：can H 2S be the third
．FASEB J ，2002，16（13）：endogenous gaseous transmitter ［J ］
1792－1798．［10］Mustafa AK ，Gadalla MM ，Snyder SH．Signaling by gasotransmit-ters ［J ］．Sci Signal ，2009，2（68）：re2．［11］耿彬，杜军保，唐朝枢．敏感硫电极法在测定心血管组织细
胞及血浆胱硫醚-γ-裂解酶/硫化氢的应用［J ］．北京大学学2005，37（5）：545－548．报：医学版，
［12］Lippert AＲ，New EJ ，Chang CJ．Ｒeaction-based fluorescent
probes for selective imaging of hydrogen sulfide in living cells ［J ］．J Am Chem Soc ，2011，133（26）：10078－10080．
（2013-03-11收稿）
理过程中H 2S 的动态变化常常不能检测，而且很多荧光探针还处于实验阶段，鲜见市售产品；（3）细胞培养瓶琼脂吸附测定方法，主要原理也是吸附细胞
然后去检测，但该方法需要的装释放的H 2S 气体，
置较为繁琐，细胞需要量大，掌控不良易引起细胞培
养过程中的气体交换，另外样本较多时操作繁琐，且很好地动误差较大。本方法采用醋酸锌滤膜吸附，态测定了H 2S ，而且在同一培养板操作，误差较小；实验装置可自行安装，简单方便且较为廉价。
亚甲基蓝法是测量液体中H 2S 气体的最佳方法之一，本研究在传统亚甲基蓝分光光度法的基础上加以改进，自制细胞培养板滤膜装置，给予酶催化使滤膜充分吸收培养基中挥发出来反应所需底物，
积累一定时间后采用亚甲基蓝分光光的H 2S 气体，
度法检测H 2S 的生成量。装置中滤膜吸附的是纯
H 2S 气体，不受培养基中其他硫化物的干扰。实验给予产H 2S 酶测量了HepG2细胞内H 2S 的产生率，CBS 或CSE 的抑制剂后，H 2S 产率显著降低；联合应用两种抑制剂，则H 2S 产率进一步被抑制，提示该方法可用于检测细胞内源性H 2S 的产生。用台盼蓝拒染法检测培养板内细胞存活率在95%以上，提示此装置的使用并未影响细胞的活力，不造成细胞毒性。我们同时检测了低表达CSE 的内皮细胞H 2S 的释放，发现内皮细胞H 2S 产率仅为HepG2细胞的1/30，提示该方法可以很敏感地测量细胞内H 2S 释放。
实验发现滤膜直径的大小与细胞培养板孔径大小的拟合度非常重要，滤膜过大覆盖培养孔会影响细胞的CO 2通气，长时间孵育造成大量细胞死亡；而滤膜过小又会造成细胞释放的H 2S 吸收不完全，因此滤膜直径小于培养孔2mm 较为适宜。另外，
（本文编辑：王蕾）