用CODEHOP设计简并引物
第39卷 第8期
2007年8月
哈 尔 滨 工 业 大 学 学 报
JOURNALOFHARBININSTITUTEOFTECHNOLOGY
Vol139No18Aug.2007
用CODEHOP设计简并引物克隆B49乙酸激酶基因片段
任南琪,林海龙,李建政,郑国香,李永丰,于振国,张 昆
(哈尔滨工业大学市政环境工程学院,哈尔滨150090)
摘 要:利用CODEHOP设计细菌乙酸激酶的简并引物,选用1对引物ACK-J1以高效产氢菌B49基因组α大肠杆菌中,发现此DNA产DNA进行PCR,得到655bpPCR产物,产物经pMD18-T载体克隆转化至DH5
物与其他乙酸激酶基因有高度的相似性.所克隆的序列为B49的乙酸激酶基因片段.用CODEHOP程序化设计的简并引物可信性强,阳性率高.该基因的成功克隆将为高效产氢菌B49代谢工程研究和降低其反应器酸化研究提供科学依据.
关键词:引物设计;CODEHOP;乙酸激酶基因;简并引物;高效产氢菌中图分类号:Q93
文献标识码:A
文章编号:0367-6234(2007)08-1225-05
Degenerateprimerdesignkinaseofthebiia
ngsoftware
RENIJ2zheng,ZHENGGuo2xiang,LIYong2feng,YUZhen2guo,ZHANGKun
(ofMunicipalandEnvironmentalEngineering,HarbinInstituteofTechnology,Harbin150090,China)
Abstract:ThisworkusedCODEHOPtodesignthedegenerateprimersofacetatekinase,choseonepairofde2generateprimersnamedACKJ1andusedthehigh-biohydrogenbacteriaB49genomeDNAastemplateto
αmakedegeneratePCR.655bpPCRproductwasobtained,whichwastransformedintotheE.coliDH5throughbeinglinkedwithpMD18-Tvectorandsequencedafterfiltration.SimilarityalignmentshowedthattheproductsoftheclonedDNAwereverysimilartothoseofacetatekinasegene.TheclonedsequencewasputativelyacetatekinasegeneDNAfragmentfromB49strain.Theresultsindicatedthatthesedegenerateprim2ersdesignedbytheCODEHOPsoftwarecouldbeusedtoobtainspecificgenefragment.Successfullycloningthisgenefragmentwouldgivethescientificwarrantforthemetabolicengineeringresearchandreducingthea2cidificationofit’sreaction.
Keywords:primerdesign;CODEHOP;acetatekinase;degenerateprimer;high2biohydrogenbacteria
近年来,由于生物制氢技术可以克服常规制氢方法的诸多缺陷而倍受关注[1].要实现生物制氢产业化,就要有高效产氢的细菌,所以,国内外研究者进行了大量的菌种分离工作,获得了许
[2-10]
多的产氢发酵细菌.其中产氢菌
收稿日期:2005-10-18.
基金项目:国家高技术研究发展计划资助项目(2002AA001036).作者简介:任南琪(1959—),男,博士,教授,博士生导师,长江学
者特聘教授.
Ethanoligenenssp.hitB49是本实验室从生物制
氢反应器的乙醇型发酵活性污泥中分离出的一株高产氢乙醇型发酵菌株,其酵解葡萄糖的主要发酵产物为乙醇、乙酸、H2、CO2和少量乳酸中乙酸在末端产物中占有很大比重.
乙酸是大多数兼性和严格厌氧微生物能量代谢的末端产物之一.反过来,乙酸也有调节中心代谢和产氢代谢的作用.在运行生物制氢反应器过程中,乙酸的大量分泌,会造成反应器中pH
的改
[10]
,其
变,而pH的变化可以改变反应器中微生物的发[11-13]
酵类型,影响反应的稳定性,其结果会抑制
[14]
细菌的生长,降低H2产量;而用碱调控pH的方法,还会增加生产成本.在乙酸生成过程中,乙酸激酶是关键酶,它控制着乙酸的最终生成.所以,克隆乙酸激酶基因,研究其在产氢代谢途径中的生理生化作用,从而为优化最佳产氢代谢过程提供依据.
本文采用CODEHOP(ConsensusDegenerate
[15,16]
HybridOligonucleotidePrimers),在线软件程序化设计简并引物的乙酸激酶基因.
[16-21]
海华舜生物工程有限公司,引物合成由赛百盛生物工程有限公司合成.Taq酶和dNTP均购自宝生物工程(大连)有限公司.112 实验方法11211 简并引物的设计在NCBI网站上对B49的16srDNA进行序列比对分析,找到相近的6个菌种.再从SwissPort和NC2BI数据库中找到这6个菌种的乙酸激酶的蛋白质序列作为引物设计的模板,分别是
Thermoanaerobacterium
thermosaccharolyticum,
ThermoanaerobactertengcongensisMB4,ClostridiumthermocellumATCC27405,ClostridiumtetaniE88,Clostridium
perfringens
,同源克隆菌E.hitB49
1 实 验
111 实验材料
111.1 主要软件
blastp(NCBI,USA);Blockmaker(FredHutchinsonCancerResearchCenter,USA);CODE2HOP(FredHutchinsonCancerResearchCenter,USA)blastx(NCBI,USA).
11112 E.hitB49的16srDNAE.hitB49Estr.13和Clostridium
acetobutylicumATCC824共6个乙酸激酶蛋白,并对
其进行序列比对分析,发现有10块保守性较强的区域.最后将比对结果提交到C服务器进
行运算,.检索主要Maxi128,Targetcla60usagetable:clos2.1.依据简并引物简Tm值尽可能高、上下游引物之距离尽可能大等原则选择了一对引物,命名为ACK-J1(表1).11212 简并扩增E.hitB49乙酸激酶DNA
按华舜总DNA提取试剂盒说明书上的方法提取B49总DNA,用设计的简并引物ACK-J1进行扩增
.
[15,18]
.B49的16Sr中进行检索比较,得出与菌株相似性最高的菌种为纤维素梭菌(ClostridiumCellulosi),其相似性为94%.与其较为相近的菌种主要有梭菌属(Clostridium)和瘤胃球菌属(Ruminococcus)的部分菌种.B49菌株的16SrDNA序列在NCBI的注册号为
[10]
AF481148.
11113 菌种材料和培养条件
B49是林明博士分离的一株高效产氢菌.B49
采用营养富集培养基,用水煮并充入氮气的方法建立厌氧环境,配制B49厌氧富集培养基.11114 菌株和质粒
α本实验室保存,pMD18-T大肠杆菌DH5
载体购自宝生物工程(大连)有限公司.11115 酶和试剂
总DNA提取试剂盒、小量胶回收试剂盒购自上
图1 用CODEHOP设计算并引物流程图
表1 扩增乙酸激酶基因的简并引物
BlockAF
引物名称
ACKJ1-FACKJ1-R
引物序列
5’TGAAAATGTATTAGCAAAAGGATTAGTAGANMGNATHGG3’
5’CCCATTGCTAATCCTTCTAAAGGNGTRAANCCCAT3’
简并度
9632
N(A,T,C或G) M(A或C) H(A,C或T) R(A或G)
PCR反应体系为100μL:10×rTaqbuffer10μL,引物ACKJ1-forward和ACKJ1-reverse浓度均各为50pmol,dNTP10nmol,DNA5ng,rTaq215U.PCR反应条件选用TouchdownPCR法:95℃预变性5min;然后94℃变性30s,从6010℃下降到5510℃退火1min,每个循环降低1℃,72℃延伸1min,共5个循环;接着按94℃变性30s,5510℃退火1min,72℃延伸1min,共进行25个循环;最后在72℃延伸10min.11213 PCR产物的检测和克隆
用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,结果见图2.在500bp到750bp之间约680bp处有单一条带,与目的条带大小相符.取100μLPCR产物上样,经恒压100V电泳30min,切割此条带,按华舜小量胶回收试剂盒说明书方法回收DNA,溶于30μLTE溶液中.克隆过程参照宝生物工程(大连)有限公司pMD18-T试剂盒说明书所述方法进行.胶回收DNA与pMD18-T载体16℃
α,37℃培养过夜,连接过夜,转化大肠杆菌DH5
挑选白斑.经RV-M和M13-47落PCR鉴定,确定阳性克隆
.
M—DL2000marker;1—空白对照;2—AK保守区简并扩增结果
图2 简并引物扩增acetatekinase基因保守区的电泳结果
11214 测序及序列比对
取2.测,输入[22.测
3
.
图3 乙酸激酶片段测序结果
2 结果与讨论
211 简并PCR电泳结果
coreregion),长度只有11～12个碱基.引物5′端
为非简并性夹板结构(5′consensusclampregion).5′端夹板结构是根据密码子偏向性设计的一致性
利用遗传密码的简并性设计简并引物是克隆蛋白质家族cDNA和基因组DNA的常规方法.但由于简并性问题,所设计的引物通常简并性过高,导致有效引物利用率过低,PCR产物非特异性增高.虽然减少简并引物长度可相对减少简并性,但由于引物Tm值过低,PCR假阳性率也会相对提高,有时不得不设计第3条引物对PCR产物进行二次巢式PCR扩增
[23-27]
序列,它最大程度地预测了保守性氨基酸的编码序列.5′夹板结构的长度取决于所需的退火温度,长度一般为20～30个碱基.这样设计的优点在于既减少了引物的简并度,又提高了引物的退火温度,保障了PCR产物的特异性
[18]
.
用CODEHOP设计的简并引物ACK-J1进行PCR扩增,得到高度特异性的PCR产物.预测产物大小为678bp,而实际产物大小为655bp,基
本上是一致的(图2).其原因可能是克隆的B49乙酸激酶蛋白质比设计引物之间序列少了几个蛋白质造成的,或者可能是去除载体序列时多去除
.
而用CODEHOP设计的引物与通常设计的简并引物不同,它设计的引物由2部分组成.引物3′端为根据4个保守氨基酸设计的核心简并区(3′
・1228・哈 尔 滨 工 业 大 学 学 报 第39卷
了一部分序列.
图2泳道2中离点样孔最近的带是基因组DNA,是基因组DNA的微弱条带,原因是基因组DNA的量过大了.212 PCR产物分析
PCR产物经pMD18-T载体克隆后测序.测
氨基酸序列与乙酸激酶有高度相似性,其中与ThermotogamaritimaMSB8的乙酸激酶序列一致性最高,为60%,与Clostridiumperfringensstr.13和HelicobacterhepaticusATCC51449的乙酸激酶序列一致性也达到53%,而证明这段DNA为乙酸激酶序列. 本实验用CODEHOP设计的简并引物,再结合TouchdownPCR和高引物浓度能较好地扩增目的片段,减少非特异片段的扩增.
得分
[***********]237237236
序结果以blastx检索genebank进行相似性比较.该核酸序列在NCBI上注册号为DQ179102.
由表2可知,克隆的B49菌株DNA所编码的
序列相似性比较
表2 用blastx检索genebank的同源性结果
期望值
8e-695e-661e-651e-654e-631e-625e-625e-62-一致性/%
130/215=60121/212=57123/212=58117/213=54120/214=56115/214=53114=53=54=acetatekinase(ThermotogamaritimaMSB8)
acetatekinase(Thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum)
acetatekinase(Thermoanaerobactertengcongensis)acetatekinase(ClostridiumacetobutylicumATCC824)
acetatekinase(ClostridiumtetaniE88)acetatekinase(HelicobacterhepaticusATCC51449)acetatekinase(Clostridiumperfringensstr.13)acetatekinase(TreponemadenticolaATCC35405)acetatekinase(ClostridiumthermocellumATCC27405)
3 结 论
1)通过采用CODEHOP,
ti-[J].ProcBio2-.
5]IRENNQ,LIQB,etal.Ethanoligenens
harbinensegen.nov.,sp.nov.,isolatedfrommolasseswastewater[J].IntJSystemEvolutMicrobiol,2006,56:755-760.
[6]YOKOIH,TOKUSHIGET,HIROSEJ,etal.Hydro2
genproductionbyimmobilizedcellsofenterobacteraero2genesstrainHO-39[J].JFermentBioeng,1997,83(5):481-484.
[7]TAGUCHIF,MIZUKAMIN,SAITO-TAKIT,etal.I2
solationofahydrogen-producingbacteriumclostridiumbeijerinckiistrainAM21B,fromtermites[J].CanJMi2crobiol,1993,39:726-730.
[8]TAGUCHIF,MIZUKAMIN,HASEGAWAK,etal.
Microbialconversionofarabinoseandxylosetohydrogenbyanewisolatedclostridiumsp.No.2[J].CanJMicro2biol,1994,40:228-233.
[9]TANISHOS,SUZUKIY,WAKAON.Fermentativehy2
drogenevolutionbyenterobacteraerogenesstrainE82005[J].IntJHydrogenEnergy,1987,12(9):623-627.[10]林 明.高效产氢发酵新菌种的产氢机理及生态学研
从高效产氢菌E.可能.
2)该DNA片段的成功克隆证实了EthanologenbacteriumB49产乙酸的分支代谢途径,为E.hitB49的代谢工程研究提供了科学依据,对提高E.hitB49的产氢能力、降低B49反应器pH等研究有一定的帮助.同时该简并引物成功应用,也初步证实了其同源克隆细菌乙酸激酶基因的能力.
3)实验结果表明,用CODEHOP软件设计简并引物是可靠的.
参考文献:
[1]樊耀亭,李晨林,侯红卫,等.天然厌氧微生物氢发酵
生产生物氢气的研究[J].中国环境科学,2002,22
(4):370-374.
[2]OHYK,SEOLEH,KIMJR,etalmentativebio2.Fer
hydrogenproductionbyanewchemoheterotrophicBacteri2umCitrobactersp.
Y19[J].
IntJHydrogenEnergy,
2003,28:1353-1359.
[3]OHYK,SEOLEH,LEEEY,etalmentativehy2.Fer
drogenproductionbyanewchemoheterotrophicbacteriumRhodopseudomonaspalustrisP4[J].IntJHydrogenEn2ergy,2002,27:1373-1379.
[4]KUMARN,DASD.Enhancementofhydrogenproduc2
究[D].哈尔滨:哈尔滨工业大学,2002.
[11]HWANGHM,JANGJN,HYUNHS.Anaerobicbio
-hydrogenproductionfromethanolfermentation:TheroleofpH[J].JournalofBiotechnology,2004,111:297-309.
[12]KHANALKS,CHENWH,
LIL.Biologicalhydrogen
production:EffectsofpHandintermediateproducts[J].InternationalJournalofHydrogenEnergy,2004(29):1123-1131.
第8期任南琪,等:用CODEHOP设计简并引物克隆B49乙酸激酶基因片段・1229・
[13]LEEJY,MIYAHARAT,NOIKIET.EffectofpHon
microbialhydrogenfermentation[J].JournalofChemicalTechnologyandBiotechnology,2002,77:694-698.[14]朱彤波,杨蕴刘,焦瑞身.大肠杆菌抗氟乙酸变株的
[20]HENIKOFFS,HENIKOFFGJ,ALFORDJW,etal.
Block+:Anon-redundantdatabaseofproteinalign2mentblocksderivedfrommultiplecompilations[J].Bioinformatics,1999,15(6):471-479.
[21]ROSEMT,SCHULA
RE,HENIKOFFGJ.Consen2
sus-degeneratehybridoligonucleotideprimersforam2plificationofdistantlyrelatedsequences[J].NucleicAcidsResearch,1998,26(7):1628-1635.[22]http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.
[23]王洪振,周晓馥,宋朝霞,等.简并PCR技术及其在基
选育及应用[J].微生物学报,2000,40(1):100-104.
[15]http://blocks.fhere.org/blocks/codehop.html.
[16]MIGUELP,LOURENOL,ALMEIDAT.Searchingfor
nitrilehydrataseusingtheconsensus-degeneratehybridoligonucleotideprimersstrategy[J].BasicMicrobiol,2004,44(3):203-214.
[17]REGEARDC,MAILLARDJ,HOLLIGERC.Develop2
mentofdegenerateandspecificPCRprimersforthede2tectionandisolationofknownandputativechloroethenereductivedehalogenasegenes[J].JournalofMicrobio2logicalMethods,2004(56):107-118.
[18]http://blocks.fhere.org/blocks/blockmkr/make-blocks.html.
[19]HENIKOFFS,HENIKOFFGJ,ALFORDJW,etal.
Automatedconstructionandgraphicalpresentationofproteinblocksfromunalignedsequences[J].Gene-
因克隆中的应用[J].遗传,2003,25(2):201-204.
[24]曾会明,王天祥,王华芳,等.白腊DREB基因克隆中简并
引物的设计[J].生物技术通讯,2004,15(4):342-345.
[25]史兆兴,王恒 ,苏国富,等.简并PCR及其应用[J].
生物技术通讯,2004,15(2):172-175.
[26]王洪振,周晓馥,宋朝霞,等.简并PCR技术及其在基
因克隆中的应用[J].遗传,2003,25(2):201-204.
[27]黄菁,王少丽,乔传令.小菜蛾酯酶基因[J].39(6):458-.
刘 彤)
COMBIS,Gene,1995,163(2):17-26.
,9个学科喜获一级学科国家重点学科称号,分别是:材料科学与工程、动力工程及工程热物理、控制科学与工程、计算机管理科学与工程.九个一级学科国家重点学科共覆盖了34个二级学科,详见下表.
一级学科
覆盖的二级学科一般力学与力学基础
固体力学流体力学工程力学机械制造及其自动化机械电子工程机械设计及理论车辆工程
一级学科
覆盖的二级学科控制理论与控制工程检测技术与自动化装置
系统工程
模式识别与智能系统导航、制导与控制计算机系统结构计算机软件与理论计算机应用技术岩土工程结构工程市政工程
供热、供燃气、通风及空调工程防灾减灾工程及防护工程
管理科学与工程
力学控制科学与工程
机械工程计算机科学与技术
仪器科学与技术
测试计量技术及仪器光电信息技术与仪器工程
土木工程
材料科学与工程
材料物理与化学
材料学材料加工工程工程热物理热能工程动力机械及工程流体机械及工程制冷及低温工程化工过程机械
管理科学与工程
动力工程及工程热物理