中药生物工程技术

第一篇 基因工程技术与中药研究（约10分）

1.生物技术：生物技术是指以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他学科的科学原理，按照预先的设计，改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需的产品或达到某种目的。

2.中药生物技术：是以现代化生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他学科的科学原理，针对中药和天然药物等现代化生命科学为基础，结合先进的工程技术手段个其他学科科学原理，针对中药和天然药物及活性成分研究、开发和生产中存在的具体问题，按照设计预先的设计，进行生物体改造或生物原料加工，使其符合中药现代化和产业化要求的一门科学技术。

3.中药生物技术的主要内容：基因工程、细胞工程、发酵工程、蛋白质工程与酶工程、抗体工程和组织工程。

4.生物技术在中药的应用：

一．生物技术在高质量中药原料的研究和生产以及中药材资源的可持续利用中有巨大的应用潜力：1.中药基因研究室中药资源保护、种植和可持续利用的重要手段，如建立珍惜濒危中药材的基因库 2.细胞工程技术为中药和天然药物人工资源的开发提供了有效途径：如克隆技术 3.发酵工程技术为现代中药的生产提供了中药手段 蛋白质工程和酶工程为中药和天然药物活性成分生产提供了最佳技术手段之一，如人参皂苷的转化

二．生物技术为提高中药和天然药物品质评价水平提供了新的实验方法，如基因鉴别技术为中药材品种鉴定提供了新手段

三．生物技术为中药和天然药物新药研究与开发提供了新的工具和途径，如生物芯片

第一篇 基因工程技术与中药研究（约25分）

1.分子生物学（概念）：对生物大分子进行结构和功能研究的一门科学，主要是核酸生物学

2.核酸的种类：DNA(脱氧核糖核酸)和RNA（核糖核酸）

3.DNA链和RNA链的形成

答：有核苷酸通过磷酸二酯键连接形成的高聚物。

4.DNA链和RNA链的区别

答：RNA链的戊糖为D-核糖，碱基有A/G/T/U四种；DNA的戊糖为D-2-脱氧核酸，碱基为A/G/T/C四种。

5.DNA的结构

答：一级结构：核苷酸的排列顺序，5’—3’方向的判断；二级结构：双螺旋结构；三级结构：超螺旋结构。

6.DNA的功能

答：DNA携带两类不同的遗传信息：一类是负责蛋白质氨基酸组成的信息；另一类是相关基因选择性表达的信息。

7.RNA的功能

答：rRNA,是构成核糖体的骨架；tRNA转运氨基酸；mRNA蛋白质合成的模板

8.真核生物的结构特殊点：1）.种类多，每一种的含量非常少；2）.3’端有poly（A）尾巴，5’端有m7G帽子。

9.DNA的生物特性

答：变性：在加热或某些试剂的作用下，配对碱基之间氢键和相邻碱基之间的剪辑堆积力受到破坏，双链DNA变为单链DNA并成为无规则的线团构型的过程称变性。DNA变性的方法有热变性法和碱变性法两种。Tm与（G+C）含量成正比。

复性：变性的DNA在一定得条件下两条彼此分开的链重新缔合成为双螺旋结构的过程称复性。复性必备的条件是：

（1）有足够的盐浓度，0.12-0.50mol/L（2）有足够高的温度

10.基因定义：指编码蛋白质或RNA分子遗传信息的基本遗传单位。基因根据功能的差别分：结构基因、调节基因和操纵基因三种。

11.原核生物与真核生物基因特征的区别

答：原核生物基因特征：（1）操纵子结构（2）蛋白质基因单拷贝（3）RNA基因多拷贝（4）结构基因是连续的，没内含子（5）大部分DNA用于编码蛋白质（6）重复序列少

真核生物基因特征：（1）大部分为断裂基因（2）编码序列为外显子（3）插入外显子之间的非编码序列为内含子（4）5’端和3’端非翻译区（5）为调控序列

12.分子杂交技术

答：原理：当带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。

探针：一种标记的DNA或RNA片段，与目的基因序列互补。

DNA印记杂交技术(southern blotting):在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过与DNA或RNA探针杂交来进行检测被转移的DNA片段，这种方法称southern blotting.

13.分子杂交的类型：Northern blotting：RNA分子从电凝胶转移到硝酸纤维素滤膜； Western blotting：蛋白质从电凝胶转移到硝酸纤维素滤膜

14.：植物细胞中DNA的提取：（1）材料的预处理（洁净、粉碎）（2）提取（CTAB法、SDS法）（3）杂志的去除

15.CTAB法的原理：

答：（1）可破坏细胞膜使DNA释放到缓冲液中（2）可保护DNA免受内源性核酸酶的降解（3）可与核酸形成复合物，在高盐溶液中可溶并且稳定，降低盐的浓度可使之沉淀出来（4）用乙醇可将复合物分离出来，核酸沉淀下来，CTAB溶于乙醇中

16.CTAB法的提取步骤：加入10%CTAB提取液进行提取—>离心分离复合物沉淀—>溶于高盐溶液中—>乙醇沉淀DNA

17.基因工程（概念）：指在体外将核酸分子插入病毒，构成遗传物质的新组合，并使之参如到原先这类分子的宿主细胞内，能持续稳定地繁殖和表达外源DNA

18.基因工程的主要内容和步骤

答：（1）获得目的基因（切）（2）构建重组DNA分子（接）（3）转化重组DNA分子（转）（4）扩增重组DNA分子（增）（5）筛选阳性重组克隆（筛）（6）提取扩增的目的基因（7）构建重组表达载体，转入宿主细胞，实现目的蛋白的表达

基因工程常用的工具酶（限制性内切酶、连接酶、聚合酶）

答：（1）限制性内切酶：概念：一类识别和切割双链DNA分子特定碱基序列的核酸水解酶。作用：通过切割DNA分子，对含有特定基因的片段进行分离、分析。运用最多广泛的是II型限制性内切酶。

（2）DNA连接酶：概念：用于将两段乃至数段DNA拼接起来的酶称为DNA连接酶。作用：催化5’磷酸基与3’磷酸基之间形成磷酸二酯键。最常用的是T4DNA连接酶。

（3）DNA聚合酶：概念：以DNA或RNA为模板，催化dNTP连续加到双链DNA引物链3’-OH末端，合成与模板互补的DNA。常用的有：TaqDNA聚合酶和大肠杆菌DNA聚合酶。

20.基因克隆载体

答：答：概念：指在特定系统中能自我复制的DNA分子。一般不带控制复制系统和调控系统。分类：克隆载体：以繁殖DNA片段为目的的载体；表达载体：用来将克隆的外源基因在寄主细胞内表达成蛋白质的载体。

21.克隆载体必备的条件：（1）复制原点（2）合适的限制性内切酶酶切点（3）筛选标记（4）拷贝数多（5）易与寄主DNA分开，便于分离

22.表达载体必备元件：（1）复制原点（2）合适的酶切位点（3）强的且能被寄主的RNA聚合酶识别的分子（4）强的转录终止序列（5）所产生的mRNA要有AUG和S-D序列

分类：（1）可分为胞内表达和分泌表达载体两类（2）按所用受体细胞，分原核细胞和真核细胞载体（3）按所产生蛋白质序列，分融合型和非融合型表达载体

23.质粒载体：以细胞质粒的各种元件为基质组建而成的基因工程载体

质粒：细菌细胞内一类独立于染色体而能自我复制的环状双螺旋小分子DNA

24.目的基因获得的方法：PCR方法（基本原理：变性、退火、延伸），自基因组文库分离，化学合成法，限制酶法，物理分离法

25.重组体的克隆与筛选：一般分遗传学直接筛选法和分子生物学（根据生物学特性）的间接法两大类。

26.外源基因的高效表达和调控

答：概念：外源基因的表达是指利用克隆入某一种载体的目的基因产生蛋白质的过程。其表达过程包括转录、翻译和后加工，每个步骤都是在各调节因子控制下完成的。其中原核基因一般只能在原核细胞中表达，真核基因可在真核细胞和原核细胞中表达。

27.DNA分子标记介绍：于DNA序列，不同生物具有不同的DNA序列，因此可根据DNA序列的差异来鉴定生物物种。

28.生物的遗传多样性与DNA的多样性

答：概念：（1）DNA多样性是指染色体等位基因中核苷酸排列的差异 （2）等位基因：指染色体同一位点处可决定某一些遗传性状的几个基因 （3）生物遗传多样性是DNA多样性的结果，DNA多样性是基因突变的结果；而基因突变可分：有利突变、中性突变和无利突变三种。

29.分子标记：指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。

广义：可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质；

狭义：DNA分子标记

可分为三类：

（1）基于分子杂交的分子标记技术；

（2）基于PCR的分子标记；

（3）DNA序列测定

30.RFLP技术（限制性内切酶切片段长度多态性）：由于不同物种基因组内限制性酶切位点的不同造成酶切后DNA片段长度发生变化，限制性片段的长度在不同个体间呈多态性现象，即称为限制性片段长度多态性。

31.DNA多态性产生的方式

答：一、基因点突变，造成原有切点消失或产生新的切点；

二、结构重排：（1）缺失、倒位或插入等引起的DNA顺序的突变；（2）多个串联重复顺序组成的高变区，由于重复顺序的拷贝数不同造成限制性内切酶识别位点在基因组中的相对位置发生改变。

32.RFLP基本步骤：靶DNA的制备—>核酸探针的标记—>杂交显示

第二篇 发酵技术及其在中药研究中的运用（约25分）

1.发酵的概念（3种）及发酵一般流程

答：概念：把利用微生物的生命活动，在有氧或无氧条件下来制备微生物菌体或其代谢产物的过程称为发酵。一般流程：菌种的选育制备—>种子的培养—>发酵—>发酵成品的提取 —>发酵产品的分离纯化。

2.发酵工程：又称微生物工程或发酵技术，是将微生物学、生物化学和化学工程学的基本原理有机结合，利用微生物的代谢、转化功能，获得有用物质的工程技术。

3.发酵工程的内容及特点

答：（1）发酵工程的内容：上游工程（菌种选育、最适发酵条件、培养基的筛选）—>发酵工程（培养基制备和灭菌，发酵罐、管路的灭菌，无菌空气的供给，种子培养，生产培养及控制，补料）—>下游工程（产品的分离纯化）

4.发酵工程的特点：（1）反应条件温和，设备简单 （2）微生物生长繁殖迅速，发酵周期短

（3）发酵原料来源广泛，价格低廉 （4）反应以微生物的自动调控方式进行 （5）易产生高分子化合物及对其转化（ 6）可对菌种进行改良 （7）可大量生产新的活性物质。

5.微生物发酵类型：微生物菌体发酵、微生物酶发酵、微生物代谢产物发酵、微生物的生物转化、基因工程发酵、动、植物细胞培养。 碳源、氮源、无6.发酵培养方法与过程： 机盐等营养物质 答：（1）表面发酵培养：固体表面发酵培养： 投资小、设备少、简单易行、适于小型化生产 （2）液体深层发酵培养：

微生物细胞在液体深层中进行纯种培养的过程。 （3）液体深层发酵培养一般流程：

7.常用工业微生物的类别（四类）及菌种的自然选育和诱变选育方法。 成品

答：（1）常用工业微生物：细菌、放线菌、酵母和霉菌。决定工业微生物发酵生产水平高低的最主要因素有三个：生产菌种、发酵工艺和提取工艺。（2）自然选育是指不经过人工处理，利用微生物的自发突变进行菌种选育的过程。

（3）诱变育种是指利用物理或化学的诱变剂处理微生物细胞群，使微生物的遗传物质染色体或DNA的片段发生缺失、到位、易位等突变，或使DNA得某一部位发生突变从而引起微生物的遗传变异，改变微生物遗传性状的过程。

8.培养基的成分、配置原则、灭菌方法

答：一、概念：培养基是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的，按一定比例配制的多种营养物质的混合物。二、成分：碳源、氮源、无机盐和微量元素、生长因子、水、代谢产物的前体、诱导物和促进剂。三、配置原则：（1）根据微生物的营养需要配置不同的培养基（2）营养成分的适当配比（3）适当的PH值（4）适合的渗透压。灭菌方法：火焰灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌、过滤灭菌、紫外线灭菌、气体灭菌等。

9.培养基的分类：（1）按培养基成分：合成培养基、半合成培养基和天然培养基（2）按物理状态不同分：液体、固体和半固体培养基（3）按培养基用途分：增殖培养基、选择培养基和鉴别培养基（4）工业发酵中培养基往往是依据生产流程和作用分为：斜面培养基、种子培养基、发酵培养基

10.种子的扩大培养：指将保藏的处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面进行活化，并逐级扩大培养以获得一定数量和质量的纯种的过程。

11.种子扩大培养流程：

菌种

瓶种

子 母斜

面

子斜 面 种子罐 发酵罐

12.发酵过程主要控制参数及控制方法

答：控制参数：（1）物理参数：温度、压力、搅拌转速、搅拌功率、空气流量、粘度（2）化学参数：PH、基质浓度、溶解氧浓度、氧化还原电位、产物浓度、废气中的含氧量、废气中CO2的含量（3）生物参数：菌体浓度、菌丝形态

控制方法：（1）温度的控制：工业生产中，因发酵中释放了大量的发酵热，需要冷却的情况较多。措施：在夹套或蛇管中通入冷水进行控制；气温较高，采用冷冻盐水进行循环式降温，可迅速达到恒温。（2）pH的控制a.在分批发酵中，常添加缓冲剂如CaCO3来控制pH；b.在发酵过程中直接补加酸、碱或补料的方式来控制，特别是补料效果比较明显

13.（一）溶氧异常下降的原因有哪些？

答：（1）污染好气性杂菌（2）菌体代谢发生异常现象（3）某些设备发生故障或工艺控制发生变化

（二）溶氧异常升高的原因有哪些？

答：在供氧条件没发生变化的情况下，耗氧量的显著减少，会引起溶氧异常上升。

特别注意：是否污染烈性噬菌体

若污染了烈性噬菌体：

产生菌尚未裂解，呼吸就受到抑制→溶氧明显上升

菌体破裂会完全失去呼吸能力→ 溶氧直线上升

14.泡沫的控制：（1）调整培养基的成分和改变某些发酵条件或改变发酵工艺来控制（2）消除已形成的泡沫，可用机械消泡和消沫剂消泡。常用消沫剂：天然油脂类：豆油、玉米油、棉籽油、菜籽油和猪油； 高碳醇、脂肪酸或酯类； 聚醚类：GP、GPE； 硅酮类：其中，以天然油脂类和聚醚类在微生物药物发酵中最为常用。

13.发酵的分类（按物理状态、操作方式）

答：根据液体深层发酵操作方式的不同，发酵过程可分为分批发酵、连续发酵和补料分批发酵三种过程。

14.分批发酵：一次性投入料液，不同代谢产物分批发酵的基本过程相同，其特点是微生物所处的环境在发酵过程中不断地变化。流程图如下

15.补料分批发酵（FBC）：是指在分批培养过程中，间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜料液的培养方法。又称为半连续培养或半连续发酵，是一种控制发酵的好方法。

16.补料对发酵的影响：（1）可以控制抑制性底物的浓度：有些基质是合成产物必需的前体物质同，浓度过高，就会影响菌体代谢，使产物产量下降；有些溶解度小，达不到应有的浓度而影响转化率，采用补料就可以解决底物抑制和浓度不够的问题。（2）可以解除或减弱分解产物阻遏：有些合成酶受到易利用的碳源或氮源的阻遏，通过补料来限制基质的浓度就可以解除这种作用。（3）可以使发酵过程最佳化：分批补料技术可使微生物保持在最大生产力状态。

17.固态发酵：指使用不溶性固态基质来培养微生物的工艺过程。既包括将固体悬浮在液体中的深层发酵，也包括在没有或几乎没有游离水的湿固体材料上培养微生物的工艺过程。实例：制曲酿酒、腌制食品、肥料堆积。其优点是：条件相对粗放；培养基简单处理，投入小，利于规模化生产；产品好，利于生物循环。

18.常见的菌类中药有冬虫夏草、茯苓、灵芝、马勃、银耳、雷丸，其活性成分是：多糖、氨基酸、生物碱、甾醇、抗生素等

19.菌类中药的液体深层发酵: (一)虫草菌丝体的液体深层发酵生产 (二)灵芝菌丝体的发酵生产 (三)、中药红曲的发酵生产P158/160

20.中药的固体发酵概念

答：（1）菌质：真菌固体发酵所生长的大量菌丝体与发酵后的基质组成的混合物。

（2）药用菌质：药用真菌于营养基质上固体发酵所生产的菌质。

（3）新型固体发酵工程：药用真菌在由中药材组成的药性基质上进行的固体发酵。

（4）药性菌质：采用由中药材组成的药性基质所产的菌质，是人工制造的新药材，产品应属中药一类新药

21.药用植物内生真菌的概念和特点

答：（1）概念：内生真菌是指其在生活史的某一段时期生活在植物组织内，对植物组织没有引起明显病害症状的真菌，包括那些在其生活史的某一阶段营表生的腐生真菌，对宿主暂时没有伤害的潜伏性病原真菌和菌根真菌。（2）植物和内生真菌的关系：互惠共生

22.内生真菌的生物多样性

答：内生真菌主要分布在植物的叶鞘和种子中。据内生真菌与宿主专一性分析，平均每种寄主有4-5种寄生菌，种类至少有10的7次方种。

23.内生真菌产生活性代谢产物的特点：（1）产生与宿主相同或相似的化学物质（2）促进宿主某些代谢产物的形成和生长

24.目前分离到的产生物活性物质的内生真菌：1.抗癌：（1）红豆杉内生真菌→紫杉醇类（2）长春花的内生真菌→长春新碱（3）桃七儿内生真菌→鬼臼毒素 2.免疫抑制：雷公藤→雷公藤甲素

25.药用动植物内生真菌发酵生产活性化合物的优点：（1）持续的生产（2）利于工业化（3）微生物的培养技术简单，容易提高产量（4）可通过基因工程等方法筛选高产菌株（5）生长迅速，易培养

26.药用真菌的液体深层发酵和固体深层发酵的工艺过程

第三篇 植物细胞工程技术及其在中药研究中的应用（约25分）

1.解释以下概念

细胞工程 ：应用细胞生物学和分子生物学的方法，借助工程学的试验 方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科

植物工程细胞：以植物细胞为基本单位，应用细胞生物学、分子生物学等理论和技术，在离体条件下进行培养、繁殖或认为的精细操作，使细胞的某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而改良品种或制造新品种的科学和技术。 植物细胞的全能性：指植物体中任何一个具有完整细胞核的细胞，在一定条件下都可以重新再分化形成原来的个体。 植物的分化：植物细胞通过分裂产生结构和功能上的稳定性差异的过程。分为胚胎发生、器官发生两个阶段。 再分化：通过脱分化诱导形成的愈伤组织在适宜的条件下再分化成为胚状体或直接分化出器官的过程。

外植体：从植物体上分离下来的用于离体培养的材料

继代培养：有最初的外植体上切下的新增殖的组织，培养一代时间称为“第一代培养”。连续多代的培养即为“继代培养”。

植物组织和器官培养：在无菌和人工控制条件下，研究植物的细胞、组织和器官的生长发育以及控制技术。 胚状体:对应于胚（embryo），在离体培养过程中产生一种形似胚, 功能与胚相同的结构。

愈伤组织：外植体经脱分化所形成的排列疏松而无规则、形态无定形的薄壁细胞聚集体。

无性繁殖系：又叫克隆，使用母体培养物反复进行继代培养时，通过同一外值体而获得越来越多的无性繁殖后代，如根无性系、组织无性系、悬浮培养物无性系等。

细胞培养：利用单个细胞进行液体或固体培养，诱导其增殖及分化的各种试验。

生理活性物质：一类对细胞内的生化反应和生理活动起调节作用的物质的总称。

后含物：是植物细胞在代谢过程中产生的储藏物质或废弃物质。

2.植物细胞工程的研究内容包括：植物组织、器官培养技术；细胞培养技术；原生质体融合与培养；亚细胞水平的操作技术等。

上游工程：细胞培养、遗传操作和保藏

下游工程：生产实践中用以生产生物产品

3.植物培养细胞的生理特性：（1）植物培养细胞重量的增加主要是取决于对数期，而次级代谢产物的累积则主要在稳定期完成（2）多以非均相集合体的细胞团形式存在（3） 抗张力强度大，抗剪切能力小（4）培养过程要不断的供氧气，但所需的溶氧水平较低（5）泡沫问题没有微生物培养时的严重。

4.植物细胞培养的基本技术

一、植物材料的准备

外植体：无杂菌材料。需用表面灭菌剂进行除菌。最常用的灭菌剂是次氯酸钙、次氯酸钠和氯化汞。

二、培养方法

原生质体培养—单倍体细胞培养—固体培养—液体培养—悬浮细胞培养—固定化细胞培养

三、固体培养的优缺点：

优点：简便易行，培养所占空间小；

缺点：1.仅有一部分接触面，生长不平衡 2.气体交换不畅，有害物质难排出

3.极化现象，细胞群体不均匀 4.测生理生化指标麻烦

四、特点

（1）外植体在培养三周左右必须移换至新鲜培养基上，以保持培养物的继续正常生长。

（2）移换一次培养基称一次继代培养。

（3）一种外植体经过一定次数的继代培养，其培养物就可用于悬浮培养。多次继代培养，愈伤组织变得较为疏松时方宜进行悬浮培养。

五、植物细胞大规模培养系统

（一）成批培养法

将培养基一次性地加入反应器，接种、培养一定时间后收获细胞的操作方式。

两步培养法：即用两个生物反应器，第一个反应器用于细胞生物量的累积，第二个反应器用于次级代谢产物的生产。

（二）半连续培养法

（三）连续培养法

5.影响植物次级代谢产物累积的因素

一、外植体的选择

不同外植体的悬浮细胞培养物，基最大次级代谢产物的累积时间各不相同。

延迟期、加速期、稳定期、与细胞生长同步

植物次生产物种类繁多（据保守估计已超过2万种）

植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工等领域有重要意义

来自于植物体和细胞培养的紫草宁含量比较

生产方式 生产周期 紫草宁含量（％干重）

完整植株 2～3年 1～2

植物细胞培养 3周 14

植物次生代谢产品的市场潜能

产品成分 用途 年销售额（亿美元）

长春花碱 治疗白血病 18～20（美国）

阿吗灵 循环系统障碍药 5～25（全世界）

奎宁 治疗疟疾 5～10（美国）

致热素 杀虫剂 20（全世界）

毛地黄 心脏病药 20～55（美国）

二、培养条件

（一）培养环境的内在因素

1.接种和诱导； 2.基本培养基元素组成（氮、磷、铜等）； 3.碳源

4.植物生长调节剂：起关键性作用 5.氧气和pH 6.渗出物

（二）两步培养法

即第一步使用适合细胞生长的培养基，称为“生长培养基”，第二步使用适于次级代谢产物合成的培养基，称为“生产培养基”。

生长培养基的特点：实现细胞的高生产率

生产培养基的特点：通常具有较低含量的硝酸盐和磷酸盐，并含有较低的糖分或较少的碳源

（三）诱导子（了解内容）

植物抗毒素：植物防御系统内能对抗微生物进攻的某些次级代谢产物。

诱导子：触发形成抗毒素信号的物质。

生物诱导子：植物体在防御过程中为对抗微生物感染而产生的物质，主要包括分生孢子、降解细胞壁的酶类、细胞壁碎片、有机体产生的代谢物等成分。

非生物诱导子：不是植物细胞中天然成分但又能触发植物细胞形成抗毒素信号的物质。

（四）培养环境的外部因素

（1）温度：20-28度。 （2）搅拌频率。 （3）培养容器的影响。 （4）光的影响

6.药用植物细胞悬浮培养与毛状根培养

一、（1）体外培养方法生产有价值的天然产物具有的优点：

1）.在人工控制条件下进行，可得到超整株植物产量的代谢产物；

2）.无菌条件，可排除病菌和虫害侵扰；

3）.特定的生物转化反应；

4）.可探索新的合成路线

（2）药用植物组织培养进行天然活性成分的生产多采用：1）.悬浮培养细胞 2）.Ri质粒转化的毛状根

二、药用植物细胞悬浮培养

悬浮培养细胞是将植物细胞和小细胞聚集体悬浮在液体培养基上进行培养，在培养过程中必须保持较好的分散状态

（一）细胞培养物的制备

1）.从外植体直接产生

2）.通过愈伤组织产生：最常用。

植物生长调节物质：生长素—IAA、NAA、2,4-D,分裂素KT、6-BA。

（二）高产细胞株的筛选

（三）悬浮培养细胞培养条件的优化

三、药用植物毛状根培养

药用植物毛状根的培养涉及到植物转基因技术和植物组织培养技术。

（一）毛状根的产生机理

毛状根是由于发根农杆菌携带的Ri质粒侵染植物而产生的。

发根农杆菌是根瘤菌科农杆菌属一类革兰氏阴性土壤农杆菌，可以侵染大多数双子叶植物和少数单子叶植物，甚至是裸子植物而诱发植物产生毛状根。

什么是毛转根（发根）？

答：发根（hairy root）是发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes)感染整体植株或其某一器官、组织、单个细胞甚至原生质体后，其Ri质粒上的T－DNA片断整合进植物细胞核基因组中诱导产生的一种特殊表现型（形成多分枝的、生长迅速的不定根）

（二）毛状根产生次生代谢产物的特点：

（1）激素自养（2）生长迅速（3）遗传和生化性状稳定（4）合成次生代谢产物能力强

7.植物细胞工程

（一）药用植物原生质体的制备、融合、培养（二）植物微繁殖技术 （三）植物脱毒技术

8.原生质体概述

（一）概念

原生质体：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。

亚原生质体：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞核。

核质体：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原生质体。

胞质体：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体

（二）原生质体的优点：可融合性和良好受体系统

（三）原生质体的分离：外植体的选择→质壁分离→酶解→原生质体的分离→活力检测→原生质体的合„„

9. 原生质体培养方法

（一）固体培养 （二）液体培养法 （三）液－固培养法

双层培养法：即在培养皿底部先铺一薄层含或不含原生质体或细胞的固体培养基，再在其上进行原生质体的液体浅层培养。

10. 原生质体的融合

答：根据融合时细胞的完整程度，可分为两大类：（1）对称融合（asymmetric fusion），即两个完整的细胞原生质体融合。（2）非对称融合（symmetric fusion）－利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合

11. 原生质体融合的方法

1）PEG诱导融合法

PEG诱导融合的特点：其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。

PEG的作用机理： Kao等认为，由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在原生质体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。

2）电融合法

与PEG融合相比，电融合有三大优点：

一是不存在对细胞的毒害问题；二是融合效率高；三是融合技术操作简便。

电融合仪的结构特点：（1）交变电场部分（2）高频直流电击部分。

12.原生质体的融合产物：

对称细胞杂种：含有来自双亲的全部染色体组成。

不对称细胞杂种：有一个融合亲本的染色体组成发生单向丢失或部分丢失。

13.植物微繁殖的概念和意义？

答：（1）概念：植物微繁殖：利用组织培养技术进行植物的快速无性繁殖的方法，也叫“快速繁殖技术”。块根、块茎、鳞茎为繁殖器官的作物，每年相当一部分产品要用留作种。如：大 蒜：留种量占产量的五到八分之一。马铃薯：留种量占产量的十分之一。贝母：留种量占产量的三分之一。（2）意义：

（1）能够有效地保持优良品种的特性（2）生产无病毒种苗，防止品种退化 （3）快速繁殖新品种，使优良品种迅速应用（4）节约耕地，提高农产品的商品率（5）便于运输

14.植物微繁殖的一般技术

答：建立无菌培养物→芽的增殖→诱导生根→试管苗的移植

15.植物脱毒技术

脱毒的方法：

物理和化学方法: 茎尖和愈伤组织

高温和低温处理/化学试剂

热处理病毒（温热疗法）原理

组织培养的方法：茎尖/愈伤组织/花粉或花药培养/珠心胚培养 （了解）

16.茎尖培养脱毒

主要因素：茎尖大小

特点：脱毒率高、脱毒速度快、但存活率低

改进措施：热处理和茎尖培养相结合

19植物微繁殖的概念、优点和一般技术。

答：概念：利用组织培养技术进行植物的快速无性繁殖的方法叫植物的微繁殖

优点：使用植物材料少，繁殖速度快、性状分化

一般技术：建立无菌培养物—>芽的繁殖—>诱导生根—>试管苗的移植

17.植物细胞、动物细胞和微生物细胞的比较。

答： 内容 哺乳动物细胞 植物细胞 微生物细胞

大小（μm） 10—100 10—100 1—10

生长形式 悬浮、贴壁 悬浮 悬浮

培养要求 很复杂 简单 简单

倍增时间（h） 15—100 20—120 0.5—5

细胞分化 有 有限分化 无

环境影响 非常敏感 敏感 一般

细胞壁 无 有 有

产物存在部位 胞内或胞外 胞内或胞外 胞内或胞外

产物浓度 低 低 高

含水量 — --90 --75

供氧需求（Kla） 1-25 20-30 100-1000

产物种类 疫苗、单抗、酶 酶、天然色素 发酵食物

激素等 天然有机化合物等 抗生素、酶等

18原生质体分离、培养、融合的方法。

答：分离的方法：质壁分离—>酶解—>分离

培养的方法：固体培养法、液体培养法（液体浅层培养法、液体小滴法、微悬滴培养法）、液固结合法（双层培养法、琼脂岛培养法）

融合的方法：PEG法、电融合法。

20.植物脱毒的方法。

答：一、物理或化学方法脱除病毒：（1）高温和低温处理（2）化学处理

二、组织培养脱除病毒：（1）茎尖培养（2）愈伤组织培养（3）花药或花粉培养（4）珠心胚培养

第四篇 生物技术及其在中药研究中的应用（约10分）

1.生物转化的概念、特点、类型（例子）？

答：概念：指利用酶或有机体作为催化剂实现化学转化的过程。

特点：生物转化反应类型多，对立体结构合成上具有高度的专一选择性，反应条件温和、低能耗、高效率，生物转化可以减少反应步骤

生物转化反应类型：（1）氧化反应（2）还原反应（3）水解反应

2.生物转化的意义及其在中药现代化中的意义？

3.微生物转化的一般实验方法和方式。

答：一般实验方法：选择菌种—>培养好成熟菌丝或孢子—>选择适宜的转化方式—>转化培养或转化菌丝及孢子悬浮液转化—>转化液的提取分离—>产品精制

方式：生长细胞转化法，静息细胞转化法，应用干细胞进行转化，应用孢子进行转化，应用固定化细胞进行转化

4.植物细胞、组织转化的概念及优缺点。

答：概念：利用职务培养细胞为酶源使某种前体化合物转化为相应产物的技术称为植物细胞转化。

优缺点：一、优点

（1）植物细胞与微生物虽然同样能催化氧化、还原等一系列的反应，但分属不同的自然分类系统，所含的酶系显然不同，代谢途径有明显的差异。而大多数天然活性成分来自植物，通过饲喂前体物质，可用作研究生物合成途径的模型。这通过微生物转化途径是很难达到的。（2）许多天然活性成分在自然界中含量很低，如红豆杉中含有的有效成分紫杉醇是抗癌和治疗白血病的有效成分，但原植物的含量只有十万分之一。用植物细胞、组织进行转化有望实现紫杉醇最重的工业化

二、缺点：植物细胞系不稳定、产率低、生长速度慢、放大不成功，生产成本较高，使植物细胞、组织进行转化的工业化更困难。

第五篇 酶工程技术及其在中药研究中的应用（约5分）

1.酶的概念以及酶工程的主要内容（酶的固定） 2.酶的生产方法

2.酶的分离、纯化的方法 3.酶的检测方法

生物技术：生物技术是指以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他学科的科学原理，按照预先的设计，改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需的产品或达到某种目的。

基因工程（概念）：指在体外将核酸分子插入病毒，构成遗传物质的新组合，并使之参如到原先这类分子的宿主细胞内，能持续稳定地繁殖和表达外源DNA

变性：在加热或某些试剂的作用下，配对碱基之间氢键和相邻碱基之间的剪辑堆积力受到破坏，双链DNA变为单链DNA并成为无规则的线团构型的过程称变性。

复性：变性的DNA在一定得条件下两条彼此分开的链重新缔合成为双螺旋结构的过程称复性。

基因克隆载体：指在特定系统中能自我复制的DNA分子。一般不带控制复制系统和调控系统。分类：克隆载体：以繁殖DNA片段为目的的载体；表达载体：用来将克隆的外源基因在寄主细胞内表达成蛋白质的载体。

RFLP技术（限制性内切酶切片段长度多态性）：由于不同物种基因组内限制性酶切位点的不同造成酶切后DNA片段长度发生变化，限制性片段的长度在不同个体间呈多态性现象，即称为限制性片段长度多态性。

限制性内切酶：概念：一类识别和切割双链DNA分子特定碱基序列的核酸水解酶。作用：通过切割DNA分子，对含有特定基因的片段进行分离、分析。运用最多广泛的是II型限制性内切酶。

发酵工程：又称微生物工程或发酵技术，是将微生物学、生物化学和化学工程学的基本原理有机结合，利用微生物的代谢、转化功能，获得有用物质的工程技术

固态发酵：指使用不溶性固态基质来培养微生物的工艺过程。既包括将固体悬浮在液体中的深层发酵，也包括在没有或几乎没有游离水的湿固体材料上培养微生物的工艺过程。

植物细胞的全能性：指植物体中任何一个具有完整细胞核的细胞，在一定条件下都可以重新再分化形成原来的个体。 再分化：通过脱分化诱导形成的愈伤组织在适宜的条件下再分化成为胚状体或直接分化出器官的过程。

脱分化：已经分化的植物器官、组织或细胞，当受到创伤或进行离体（也受到创伤）培养时，已停止分裂的细胞，又重新恢复分裂，细胞改变原有的分化状态，失去原有结构和功能，成为具有未分化特性的细胞。

愈伤组织：外植体经脱分化所形成的排列疏松而无规则、形态无定形的薄壁细胞聚集体。

外植体：从植物体上分离下来的用于离体培养的材料

胚状体:对应于胚（embryo），在离体培养过程中产生一种形似胚, 功能与胚相同的结构。

继代培养：有最初的外植体上切下的新增殖的组织，培养一代时间称为“第一代培养”。连续多代的培养即为“继代培养”。

植物微繁殖概念：利用组织培养技术进行植物的快速无性繁殖的方法叫植物的微繁殖

毛状根：又称发状根。整体植株或某一器官、组织（包括愈伤组织）、单个细胞，甚至原生质体受到发根农杆菌的感染所产生的一种病理现象，是细胞中质粒的T-DNA插入寄主细胞核基因组而得到的表现型，主要是在感染部位上或附近能产生大量的副产物-毛状根。

生物转化指利用酶或有机体作为催化剂实现化学转化的过程。

对称融合（asymmetric fusion），即两个完整的细胞原生质体融合。

非对称融合（symmetric fusion）－利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合

细胞工程 ：应用细胞生物学和分子生物学的方法，借助工程学的试验 方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科

影响植物细胞组织转化的因素：植物培养物的种类、株系、生长阶段；外源化合物的影响；培养条件（培养基的组成；植物激素；其他：培养基起始PH、光照、温度）

酶工程：研究酶的生产和应用的技术过程，包括酶的制备、酶的固定化、酶分子修饰与改性和酶反应器等。

酶工程是指利用酶,细胞或细胞器等具有的特异催化功能,借助生物反应装置和通过一定的工艺手段生产出人类所需要的产品.它是酶学理论与化工技术相结合而形成的一种新技术.分为（1）生产酶（2）应用酶。

植物细胞与组织培养的基本过程包括如下几个步骤：第一步，从健康植株的特定部位或组织，如根、茎、叶、花、果实、花粉等，选择用于培养的起始材料（外植体）。第二步，用一定的化学药剂（最常用的有次氯酸钠、升汞和酒精等）对外植体表面消毒，建立无菌培养体系。第三步，形成愈伤组织和器官，由愈伤组织再分化出芽并可进一步诱导形成小植株。另一途径是用外植体或愈伤组织细胞经液体悬浮培养诱导胚状体再长成植株。胚状体的形成可大大提高繁殖效率，并可减少变异

基因工程的实施包括四个必要条件：工具酶、基因、载体和受体细胞。

生物技术主要是指基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、蛋白质工程。

细胞工程包括植物细胞的体外培养技术、细胞融合技术、细胞器移植技术、克隆技术、干细胞技术。

RFLP的优缺点？优点1普遍性：从DNA病毒到高等真核生物，RFLP普遍存在2稳定性：传统的形态学和同功酶标记研究的是基因转录翻译后加工的产物，甚至是多基因控制的表现型，而RFLP研究的是遗传物质本身，因此不受显隐性关系、环境条件、发育阶段的影响，没有组织器官特异性；3共显性：大多数RFLP带型呈共显性，可容易地将杂合体和纯合体分离出来，进而可以得到更多的遗传信息。4无限性：探针与限制酶的组合数量无限，即使异源基因也可以作为探针。

局限性：1在DNA中，单个碱基的替换大量存在，但用RFLP仅能检测出影响到限制性内切酶识别位点的突变，这在很大程度上限制了RFLP技术的应用；2RFLP需进行多种酶切、标记、转移、分子杂交等工作，步骤多，工作量大，而且接触的放射性污染也多，给大量研究带来一定的困难；3RFLP分析技术要求DNA无显著降解，因此只适用于新鲜的材料，难适用于干燥药材的鉴别；虽然对PCR产物进行RFLP分析能在一定程度上克服药材中DNA降解的问题，但PCR产物的片段长度有限，一般在1.5kb以下，因此能找到的合适的限制性酶切位点数有限；4限制性内切酶价格比较昂贵。

新型固体发酵工艺的概念。真菌与其他植物、动物类药材间有机结合的复合型中药生产工艺。

植物细胞悬浮培养的一般方法（1）细胞培养物的制备：从外植体直接产生或通过愈伤组织产生（2）高产细胞株的筛选（3）悬浮培养细胞培养条件的优化：生长和生产培养基的优化：碳源、氮源的选用，生长调节剂的选用和配比等；培养环境的优化：光照、温度、溶氧量、PH等。

DNA指纹技术：利用多位点小卫星探针与RFLP电泳图谱带的DNA杂交，经放射自显影产生具有许多条带的复杂图谱，这种图谱的带型在不同种属，甚至在同一群体中不同的个体间也有明显的差异，与人的指纹相似，表现出高度的个体特异性，可用于进化和分类地位的研究。

RFLP技术基本步骤：靶DNA的准备——核酸探针的标记——杂交显示

PCR-RFLP:又称CASP技术，是先对模板进行PCR扩增，然后将PCR产物用限制性内切酶酶解，用凝胶电泳将DNA片段分开，用EB染色，观察。

中药生物技术在种质资源开发、鉴定的应用

1 利用生物技术保护与发展药用植物种质资源：离体保护可通过保存植物体的器官和组织来达到保存种质的目的。如种子库法, 即将种子经干燥处理, 使含水量降低, 然后置于密封容器内, 保存于摄氏零度的环境中, 可在10年内保持其生活力, 继续降低贮藏温度还可再延长保存时间。此外, 植物组织细胞离体系统超低温（-196度）保存技术的研究也正在兴起, 超低温保存不仅能长期保存无性繁殖植物的优良品种和育种工作所需要的纯系, 还可解决组织和细胞继代培养中的变异问题, 保存稀有和濒危的种质资源, 有利于国内外种质交换。目前超低温保存已在40多种植物中获得成功, 其中药用植物有浙贝母及杜仲等。

用组织培养方法进行快速无性繁殖也是行之有效的方法。利用此方法, 在实验室内大量繁殖稀有、珍贵而难繁殖的植物, 有效地减轻野生资源的生存压力− 通过快速繁殖, 实现工厂化生产, 可大量生产药用植物中的有效成分;同时, 还可用于脱病毒和育种工作, 繁殖和保存去病原菌的植物, 从而达到复壮原种, 提

高品质和产量的效果。如怀地黄脱病毒苗在生产上取得增产5-7倍的效果, 山西育成拘祀多倍体新品种。 2利用分子生物技术进行药用植物种质资源的分类与鉴定：DNA指纹技术是近年来发展起来的一组可以检测出大量DNA位点差异性的分子生物技术, 因它们的电泳谱带类似人的指纹图谱而得名, 这些技术包括RAPD，AFLP，RFLP,PCR-RFLP等。该技术直接分析遗传物质本身, 排除了环境因素的干扰, 同时该方法可以获得远比传统方法更多的遗传标记。DNA指纹技术的建立是植物资源学研究方法的重大突破, 为药用植物种质资源的分类与鉴定开辟了一条新途径。如RAPD技术用于人参、西洋参、细辛、龙胆草、蒲公英、溪黄草等的鉴定已获得成功。DNA指纹技术也能为寻找新的药用资源提供线索, 根据亲缘关系相近的植物类群具有相似的化学成分的规律, 通过准确确立植物间的亲缘关系, 有目的地在某些类群中寻找新成分、新药源。 中药生物技术在品质鉴定方面应用

1蛋白质电泳技术：生物样品中富含蛋白质分子。各种分子电荷性质、电荷数和分子量各不相同，在同一电场作用下。一定时间内各组分泳动的方向、速度和距离也不相同，结合谱带条数和染色不同可以达到鉴别的目的。蛋白质电泳技术简单实用被较早地应用于中药材鉴别中。

2．DNA指纹图谱技术的应用：DNA指纹图谱技术是以生物基因组DNA序列多样性为基础，研究不同物种间遗传差异的一项技术。生物在长期进化过程中由于各种原因。在基因组水平上产生了广泛的变异，在物种间甚至个体问产生了高度多态性，这种多态性不因组织器官和个体发育而有所改变，可以通过对相应位点或片断的考查检出，通过多态性图谱的形式表现出来。中药鉴定中应用较多的主要有限制性长度片段多态性RFLP、随机扩增多态性DNARAPD、扩增片段长度多态性AFLP.,以及其它一些基于PCR的技术。RFLP和AFLP适于对新鲜样品进行分析，其可靠性和稳定性较高，用于对原生物进行鉴定为一理想选择，但其对实验人员和设备要求较高，技术也稍显复杂，使其成本大大增加，因此限制了它们的应用。RAPD技术具有广泛性和通用性，合成的一套引物可用于不同生物基因组的分析，对DNA的质量要求较低，允许快速、简单地分离基因组DNA，因此可操作性很强。RAPD技术也比RFLP和AFLP简便易行，分析速度快，可实现自动化，非常适合于近缘种、易混淆品种、珍稀品种、陈旧药材、腐烂药材及样品量极为有限的中药出土标本、古化石标本等珍贵样品的鉴定，同时RAPD多态性较强，可以进行相应的遗传关系分析。

3 DNA序列分析技术: 特定基因序列也存在广泛的变异，这种变异既有种属间的多态性又有种属内的保守性。近年来，由于DNA测序技术的发展和对一些基因结构、功能的进化规律的认识，一些基因已用于动植物的进化与分类、物种鉴定研究。DNA直接测序技术不仅使结果准确、可靠，更能够进行大通量的分析比较，同时利用已知基因的序列测定结果，可以直接利用高特异性PCR引物进行快速鉴别。分别为：DNA测序技术，特异引物PCR, DNA芯片技术.