大规模动物细胞固定化培养研究进展

第25卷第2期南　京　工　业　大　学　学　报V ol. 25N o. 2

　　　　　　　　　　　　　　

2003年3月Mar. 2003JOURNA L OF NAN J I NG UNI VERSITY OF TECH NO LOGY

大规模动物细胞固定化培养研究进展

黄任远1, 胡云龙2, 陈国广1, 沈树宝1, 胡永红1, 欧阳平凯1

(1. 南京工业大学制药与生命科学学院, 江苏南京　210009;

2. 南京师范大学生命科学学院, 江苏南京　210097)

摘　要:。, 无的场效应、关键词:细胞固定化; 微载体; ; Ξ

中图分类号:Q8131+A :1671-7643(2003) 02-0104-04

　　、医学研究中所, 现在已发展成

生物医药高技术产业的重要组成部分。目前在这方面的研究主要集中在改进细胞特性, 优化细胞环境, 扩大生产规模和提高目的产物的产率与产量等几方面。细胞固定化技术可较好地保护细胞, 提高细胞对机械和化学环境所造成压力的耐受性, 实现细胞高密度培养, 提高目的产物产率。因此, 固定化培养是目前解决传质与细胞损伤这一矛盾的主要方法, 成为目前动物细胞培养过程中的主要培养方式。

目前, 动物细胞培养过程中的生物反应器设计主要是在开发新型载体的基础上, 结合最新的细胞生理学, 流体传质等相关学科的最新进展, 对生物反应器进行设计和开发。本文将就最近国内外的新型载体及其反应器研制进展进行综述, 并尝试对其整体性能进行评价。

这方面的研究多是对传统的载体形态的改进以增强载体的某种性质。如对载体表面孔径分布, 粗糙度的优化可以改善细胞贴壁效果, 膜载体之间的相对位置可引起培养基的分布变化和流体环境的差异等。

(3) 基于载体的整个培养系统的构建和优化。主要是载体固定化与悬浮、床层等培养方式相结合, 同时应用新的培养体系, 寻求最佳的培养效果。

不论何种载体, 都要从操作简便性、系统稳定性、经济合理性、生物相容性和细胞保护性等几个方面考虑, 尽量满足细胞培养过程中的苛刻要求。111　微载体细胞固定化

现有的各种微载体有着许多共同的优点和缺点[2]。其主要优点为:比表面积大; 易于检测和控制培养系统环境因素和细胞的生长; 培养基利用率高; 可实现无细胞过滤, 优化下游工程; 可系统化、自动化、减少污染; 提供了更近于体内环境的三维立体环境, 细胞在微载体上可克服接触抑制, 形成多层生长。而其最主要的缺点是载体对培养基成分的吸附。最近有研究表明, 微载体培养过程中还存在着细胞培养过程中的细胞表现出的各种生理状态的滞后问题[3]。

目前微载体的研究集中在对载体材料以及载体形态和表面理化性质的改进。从材料方面讲, 目前有机与无机材料的微载体都有报道, 并且有些已经

1　细胞固定化载体

细胞固定化技术中的首要问题是相关固定化载体的制备。固定化载体技术主要的研究方向集中在以下几个方面[1]。

(1) 对载体材料的开发与利用。其中包括载体各种理化性质和表面特性的优化与重组。

(2) 对载体各种形态的研究与开发。目前有关

Ξ收稿日期:2002208230

基金项目:国家自然科学基金(N o. 29976019和N o. 20176018) , 江苏省自然科学基金(N o. BK 99123和N o. BK 200201) 作者简介:黄任远(19792) , 男, 甘肃金昌人, 硕士研究生, 主要研究动物细胞培养相关反应器及工艺。

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实现了商品化[4]。国外还有诸如多种生物降解聚合物[3,5]、大孔纤维素微载体[6]、生物活性玻璃[7]等新型微载体。Charies [8]等人开发了氟碳化合物液膜微载体。这种液体微载体的微珠形成、细胞贴壁、培养均在搅拌下进行, 可通过混合物的离心分离使细胞游离地悬浮于有机相和培养基相之间, 用移液管即可方便移出, 克服了固体微载体吸附血清、易于变性而仅可一次性使用及培养后的分离过程损失细胞等缺点。这一技术由于操作和成本等原因而有望在工业化规模的生产过程中得到应用。

Boudreault P [9]等人利用培养过程中的微载体相

材料的选择和膜组件的设计是膜载体固定化技术中的核心内容。

制备膜的材料具有广泛的选择范围。无论是有机膜还是无机膜, 都有适合细胞培养的膜材料[14]。同时, 对膜的表面加工等工艺也有了很大的发展。对膜而言, 如何降低膜表面的生物毒性, 优化膜表面的几何形状, 提高膜的选择性和通透性, 是其主要的研究内容。培养的特点, 。Anselme [15]等, 发现G loeckner [16]等人设计的一种新, 用膜将之分割成几个区域, 通过膜的分离作用对产物进行初步的分离, 同时还增加了氧的传递效率。114　无载体细胞絮凝固定化

互聚集的特点, 研究了一种新的微载体反应器, 的解决。。112　微囊固定化

微囊化为细胞创造了一个微生态环境, 有利于保护细胞。同时, 由于细胞生长和维持于一个较小体积的培养液中, 富集细胞及其产物, 简化了下游加工技术。通过生物微胶囊固定化培养, 使培养过程与分离过程有机的结合起来, 充分体现了生物微胶囊固定化的优势。

微囊包被材料为细胞提供保护性环境, 因而膜材料化学成分将直接影响微囊的生物相容性和物理稳定性。目前以海藻酸钠2聚赖氨酸2海藻酸钠(APA ) 微囊技术发展最为成熟。研究发现, 海藻酸的纯度与微囊的生物相容性直接相关[10]。金属有机物[11], 硅化微晶纤维素[12]等新型的微囊化材料也在实验室规模取得了一定的成功。在对微囊的形态进行重新设计的过程中, Y amam oto 等人设计了微囊与中空纤维膜相结合的新型微囊化技术和反应器[13], 中空纤维减小了气体传质对微囊的损伤, 增加了整体的稳定性, 取得了较好的效果。

微囊固定化最大的问题是由于制备过程采用化学方法, 使得其性质很不稳定, 质量标准难以控制。同时, 微囊化培养过程中的消毒、清洗复杂且易染菌。上述缺点最终导致整个系统的不稳定性增强, 这是微囊化技术的应用受到限制的主要原因。113　膜载体固定化

用膜作为固定化的载体具有系统稳定、操作简便、经济廉价等优点。如果选用合适的膜, 还可具有良好的生物相容性和机械强度。在这种情况下, 膜

近年发现, 某些种类的细胞自身之间会发生絮凝作用, 形成类似菌胶团的细胞聚合体[17]。利用这种性质, 可以对某些细胞进行有意识的细胞自絮凝, 而不必添加化学絮凝剂。细胞所形成的聚合体在传质和生物活性方面都要较其他的固定化方法好。但是相对于其他的固定化方法, 这种固定化方法在稳定性上有很大的缺陷, 容易受到各种因素的破坏, 致使其应用受到限制。

2　动物细胞培养反应器系统

传统的动物细胞培养的生物反应器都来源于发酵工业中使用的各种类型的发酵罐, 而且这种现象预计在很长一段时间内无法改变[18]。诸如各种搅拌式, 气升式反应器, 还有各种床式、中空纤维膜式反应器[2], 因经过长期的使用而积累了大量的数据并有了很大的改进, 还将继续得到使用。目前, 动物细胞培养反应器系统中逐渐应用的包括以下几个方面。211　多细胞混合培养体系近年发现, 一些动物细胞在一起时也存在互利共生的现象[19]。G hanem [20]等人设计了一种新型培养器可同时培养多种细胞, 将不同的细胞通过膜来分隔并置于不同的区域培养, 同时实现了培养基的梯度利用。而将具有共生效应的几种细胞系放在一起培养, 可减少彼此的代谢产物对细胞的毒性, 同时还可以提高产物的产量, 甚至实现多产物收集。但

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是这一技术的关键问题即究竟什么样的细胞系会具

有共生效应还缺乏理论依据, 目前只能通过实验来搜寻, 而且效果很不明显。212　物理场效应细胞培养体系

各种物理场如静电场、磁场等都会对细胞的代谢产生一定的作用[21,22]。物理场对细胞的刺激作用存在阈值, 不同的物理场对不同细胞存在不同的场效应。人们目前对各种物理场对细胞的刺激效应有了一定研究并试图将之应用到动物细胞培养体系之中。Bowlin 等人[23]证实细胞经电场作用刺激后, 其生理活性又有很大的提高, 胞外某些物质的含量也有明显的上升, 细胞培养的效率。同时, 胞产物的分离[24]213　G loeckner ]新的纳米技术, 可以在载体表面附着一些生物功能

性分子, 对培养过程进行一定的调节; 同时, 通过不同的生物以及选择不同的加入时间, 可望实现培养过程的阶段性调控。但是目前有关这方面的研究仍多集中在对无机膜的修饰和对无机分子的研究, 生物大分子的应用仍处在尚未开发的阶段[25]。3. 3　动物细胞培养系统在利用新技术, 实现新工艺

的同时, 的关系。。

物的优点, 同时具备一定的生物应激性, 另外膜组件的形式对于各种新技术的应用具有较好的兼容性, 因而具有很大的发展空间, 成为我们今后在这方面开展研究的一个重要思路之一, 在今后的工作中作为重点的内容加以考虑。参考文献:

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础, 开发了一种具有多腔室构造的新型生物反应器。

这种生物反应器的最大特点是用膜将反应器分隔为两个以上的腔室, 通过膜的分离达到初步的分离效果。同时还用膜来进行氧气的传递, 减少气泡的生成, 对长期培养过程中的细胞没有不良的影响。但是这种反应器仍旧处于前期的研究阶段, 距离工业化生产还有一定的距离。

可以看出, 目前发展起来的几种细胞培养体系无论从理论上, 还是实际操作中都不够成熟, 在系统稳定性、质量标准化、操作可行性等方面都存在许多的问题, 需要加以改进。

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3　总结与展望

综上所述, 目前动物细胞进行固定化培养技术

及相应反应器装置还存在着下列不足。3. 1　各种固定化载体均就某一方面的性能作了一些改进, 但是总体上还不能很好地同时满足操作简便、系统稳定、经济合理、生物相容性好以及对细胞的机械保护等诸多要求。研发出新型的固定化载体以满足上述要求, 是动物细胞固定化培养技术继续发展的一个主要瓶颈。3. 2　在细胞的固定化培养过程中, 往往忽略了载体对细胞的生物学作用。即只注意了载体对细胞的机械保护而忽略了载体对细胞代谢过程的影响和调控。尝试研制具有一定的生物功能的细胞固定化载体, 是载体研究中的一个全新的领域。结合当今最

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Development of large 2scale immobilized mammalian cell culture

HUANG Ren 2yuan 1, HU Y un 2long 2, CHE N G uo 2guang 1, SHE N Shu 2bao 1, HU Y ong 2hong 1, OUY ANG Ping 2kai 1

(1. C ollege of Life Science and Pharmacy , Nanjing University of T echnology , Nanjing 210009, China ;

2. C ollege of Life Science , Nanjing N ormal University , Nanjing 210097, China )

Abstract :A critical aspect about the imm obilized mammalian cell culture is the design of novel bioreactors based on im 2m obilized carriers. In this paper ,the development of bioreactors and the carrier for imm obilization of mammalian cell cul 2ture , such as micro 2carrier , micro 2encapsulation , self 2flocculation of mammalian cell culture and membrane carrier were reviewed. M oreover , the field effect , multiple chambers and mixed culture of various mammalian cell lines were evaluat 2ed.

K ey w ords :cell imm obilization ; micro 2carrier ; micro 2encapsulation ; self 2flocculation ; membrane ; field effect