酵母对无机硒的富集及其影响因素
２００６年第４期１２月出版
食品工程
３７
酵母对无机硒的富集及其影响因素
Ｉｎｏｒｇａｎｉｃｓｅｌｅｎｉｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄｉｎｙｅａｓｔａｎｄｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇｆａｃｔｏｒｓ
杨丽华＊代国庆
马兴
（内蒙古农业大学生物工程学院，呼和浩特０１００１８）
ＹａｎｇＬｉ－ｈｕａ＊ＤａｉＧｕｏ－ｑｉｎｇＭａＸｉｎｇ
（Ｃｏｌｌｅｇｅｏｆｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｉｎｎｅｒｍｏｎｇｏｌｉａａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｕｈｈｏｔ０１００１８，Ｃｈｉｎａ）
摘要在蔗糖培养基中添加无机硒，利用生物
转化技术，通过酵母的生命活动，将无机硒有效的富集到细胞内，研究不同的碳源、硒离子浓度、通气量、加硒时间与不同方法对酵母的生物量及细胞含硒量的影响。结果表明，硒离子浓度对酵母的生长繁殖能力影响较大，浓度越高，酵母细胞含硒量越大，但达到某一个峰值后又开始下降；在对数生长期加硒，保持适当的通风量有利于酵母的生长和对硒的富集。
关键词酵母含硒量生物量
ＡｂｓｔａｃｔｓＩｎｏｒｄｅｒｔｏｓｔｕｄｉｅｄｓｏｍｅｆａｃｔｏｒｓｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇｔｈｅｙｅａｓｔ’ｓｂｉｏｍａｓｓａｎｄｔｈｅａｍｏｕｎｔｏｆｓｅｌｅｎｉｕｍｉｎｃｅｌｌ，ｓｕｃｈａｓｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅ，ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ
ｔｈｅａｍｏｕｎｔｏｆｖｅｎｔｉｌａｔｉｏｎ，ｔｈｅｔｉｍｅａｎｄｔｈｅｓｅｌｅｎｉｕｍｉｏｎ，
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄｓｏｆａｄｄｉｎｇｓｅｌｅｎｉｕｍ，ｂｙａｄｄｉｎｇｔｈｅｉｎ－ｏｒｇａｎｉｃｓｅｌｅｎｉｕｍｔｏｔｈｅｓｕｃｒｏｓｅｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍ，ｕｓｉｎｇｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｔｈｒｏｕｇｈｙｅａｓｔ’ｓｖｉｔａｌｍｏｖｅｍｅｎｔ，ａｎｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｎｇｔｈｅｉｎｏｒｇａｎｉｃｓｅ－ｌｅｎｉｕｍｉｎｔｈｅｃｅｌｌ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｏｎｃｅｎ－ｔｒａｔｉｏｎｏｆｓｅｌｅｎｉｕｍｉｏｎｈａｄｂｉｇｇｅｒｉｎｆｌｕｅｎｃｅｔｏｔｈｅａｂｉｌｉｔｙｏｆｙｅａｓｔ’ｓｇｒｏｗｔｈｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｄｅｎｓｉｔｙｗａｓｔｈｅｈｉｇｈｅｒ，ｔｈｅｈｉｇｈｅｒｓｅｌｅｎｉｕｍｑｕａｎｔｉｔｙｉｎｔｈｅｙｅａｓｔｃｅｌｌ．Ｂｕｔａｆｔｅｒａｃｈｉｅｖｉｎｇｓｏｍｅｐｅａｋｖａｌｕｅ，ｔｈｅａｍｏｕｎｔｏｆｓｅｌｅｎｉｕｍｓｔａｒｔｅｄｔｏｄｒｏｐ；Ｉｔｗａｓａｄｖａｎｔａｇｅｏｕｓｔｏｙｅａｓｔ’ｓｇｒｏｗｔｈａｎｄｓｅｌｅｎｉｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｂｙａｄｄｉｎｇｔｈｅｓｅｌｅｎｉｕｍｉｎｔｈｅｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃｇｒｏｗｔｈｐｈａｓｅａｎｄｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇｔｈｅｓｕｉｔ－ａｂｌｅｖｅｎｔｉｌａｔｉｏｎ．
ｋｅｙｗｏｒｄｓＹｅａｓｔＳｅｌｅｎｉｕｍｑｕａｎｔｉｔｙＢｉｏｍａｓｓ
＊杨丽华，女，１９７１年出生，２０００年毕业于华中农业大学，硕士，讲师。
２００６－０７－１１收稿日期：
微量元素硒对生命过程有着重要作用，能清除
体内过多的活性氧自由基，从而延缓人体衰老，预防肿瘤、心血管等疾病，增强机体的抵抗力。人体中的硒主要从饮食中获得，但天然食物中硒含量普遍较低。因此，在食品中补硒得到广泛认同。当前，富硒制剂主要有两类，一类是无机硒，但过量具有毒性，所以多用于医药而非食品；另一类是通过人工方法把无机硒转化为有机硒，此法既可以降低硒的毒性，又能提高硒的生理活性与吸收率，是制备富硒食品的有效途径之一。
目前有机硒的获得主要有：微生物转化法、植物天然种子发芽转化法、动物转化法等。其中微生物转化法较多的是培养富硒酵母，所用的菌种多为啤酒酵母。
本实验采用多株法国鲜酵母及酿酒酵母，在培养基中添加无机硒盐，利用酵母的生命活动将无机硒离子转化吸收入酵母细胞内，实验摸索了硒离子浓度、通气量，加硒时间与不同方法对酵母的生物量及细胞含硒量的影响，为下一步的中试提供基础。
１材料与方法
实验菌种
Ｆｘ－１、Ｆｘ－２、Ｆｘ－４、Ｚｘ－４、Ｚｘ－１０、Ｚｘ－１３分别为６种酵母菌种。
其中Ｆｘ系列为法国鲜酵母，Ｚｘ系列为酿酒酵母。由湖北安琪酵母有限公司研发中心菌种保藏实验室提供。１．２实验材料１．２．１培养基组成
蔗糖，麦芽糖，葡萄糖，果糖，乳糖，半乳１．１
３８食品工程
２００６年第４期
糖，蜜二糖，酵母粉，糖蜜，琼脂。１．２．２试剂
质量分数１％Ｎａ２ＳｅＯ３；ＭｇＳＯ４；ＫＨ２ＰＯ４。１．２．３仪器
生物安全工作台，恒温摇床，电热恒温培养箱，卧式圆形压力灭菌锅，离心机，普通显微镜，原子吸收分光光度计。１．３实验方法
１．３．１培养基的制备见表１
表１
培养基配比
单位：ｇ／１００ｇ
编号碳源氮源无机盐
１麦芽糖∶１０酵母粉∶２ＫＨ２ＰＯ４∶０．１；ＭｇＳＯ４∶０．１２蔗糖∶１０酵母粉∶２ＫＨ２ＰＯ４∶０．１；ＭｇＳＯ４∶０．１３葡萄糖∶１０酵母粉∶２ＫＨ２ＰＯ４∶０．１；ＭｇＳＯ４∶０．１４果糖∶１０酵母粉∶２ＫＨ２ＰＯ４∶０．１；ＭｇＳＯ４∶０．１５乳糖∶１０酵母粉∶２ＫＨ２ＰＯ４∶０．１；ＭｇＳＯ４∶０．１６半乳糖∶１０酵母粉∶２ＫＨ２ＰＯ４∶０．１；ＭｇＳＯ４∶０．１７
蜜二糖∶１０
酵母粉∶２
ＫＨ２ＰＯ４∶０．１；ＭｇＳＯ４∶０．１
将表１中不同配比的培养基分别溶于蒸馏水，调ｐＨ为４．８￣５．０，将配好的培养基置于灭菌锅中，１２１℃灭菌３０ｍｉｎ，冷却备用。１．３．２菌种活化
挑取斜面菌种一环，接种于备用的液体培养基中，３０℃振荡培养２４ｈ，作为种子液。１．３．３培养条件
富硒酵母的培养条件：２５０ｍＬ三角瓶中装液体ＹＥＰＳ培养基１００ｍＬ，无菌接种，接种量为５ｍＬ／１００ｍＬ，加入质量分数１％Ｎａ２ＳｅＯ３溶液，恒温摇床中，３０℃，２００ｒ／ｍｉｎ培养２４ｈ。１．３．４最佳碳源的选择
将Ｆｘ－１、Ｆｘ－２、Ｆｘ－４、Ｚｘ－４、Ｚｘ－１０、Ｚｘ－１３６个酵母菌种在无菌条件下分别接种到七种培养基中，然后将这些培养液倒入含有杜氏管的小试管中，放入３０℃恒温培养箱中培养２４ｈ，观察其产气情况，产气多则说明对碳源利用较好。１．３．５影响酵母富集无机硒的因素１．３．５．１硒质量浓度
所用的６个菌株，在接种的同时加入１％的Ｎａ２ＳｅＯ３溶液，使质量浓度分别为３０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、１２０μｇ／ｍＬ，振荡培养２４ｈ后，检测富硒酵母的含硒量及生物量。
１２月出版
１．３．５．２通气量
以Ｆｘ－２和Ｚｘ－４为出发菌株，５００ｍｌ三角瓶装液分别为１００ｍＬ、１５０ｍＬ、２００ｍＬ、２５０ｍＬ、３００ｍＬ，Ｎａ２ＳｅＯ３浓度为６０μｇ／ｍＬ，培养２４ｈ后检测富硒酵母的含硒量及生物量，
１．３．５．３时间
选取Ｆｘ－２菌株，固定培养液中的Ｎａ２ＳｅＯ３浓度为６０μｇ／ｍＬ，在接种后０ｈ、２ｈ、４ｈ、６ｈ、８ｈ、１０ｈ、１２ｈ、１４ｈ、１６ｈ的不同时间内一次性加入Ｎａ２ＳｅＯ３溶液，培养２４ｈ后检测富硒酵母的含硒量及生物量。
１．３．６富硒酵母的生物量测定
将培养好的酵母液倒入离心管中，洗涤三角瓶，将洗涤液一并倒入离心管，在４５００ｒ／ｍｉｎ下离心５ｍｉｎ后，用蒸馏水洗涤３次，离心沉淀３次，然后称量沉淀物，计算酵母湿重，即生物量。１．３．７富硒酵母的含硒量测定
原子吸收分光光度计法测定。
２
结果与讨论
２．１
酵母对不同碳源的吸收利用情况见表２
表２酵母对不同碳源的吸收利用情况（产气量）菌种
Ｆｘ－１Ｆｘ－２Ｆｘ－４Ｚｘ－４Ｚｘ－１０Ｚｘ－１３麦芽糖４／５３／４１／３气体很少１／２气体气体气体无气泡蔗糖满管满管满管满管满管满管葡萄糖满管满管满管满管满管满管果糖很少
２／３气体很少
４／５气体很少
很少
乳糖无气泡无气泡无气泡无气泡无气泡无气泡半乳糖满管满管满管满管满管满管蜜二糖
满管
满管
满管
满管
满管
满管
从表２中可以看出：６个菌株对蔗糖、葡萄糖、
半乳糖、蜜二糖能充分利用，说明这四种糖可为菌株的生长繁殖提供碳源，相比蔗糖的价格较低，故选用蔗糖为酵母培养基碳源。２．２硒浓度对酵母的影响
实验结果见下页表３。由表３可知：ａ）富硒酵母生物量随Ｎａ２ＳｅＯ３浓度的增加而逐渐降低，说明Ｎａ２ＳｅＯ３的浓度越大对酵母的生长的抑制作用也越大；
ｂ）富硒酵母的含硒量随Ｎａ２ＳｅＯ３浓度的增加而
２００６年第４期１２月出版
杨丽华，等：酵母对无机硒的富集及其影响因素３９
表３
培养液Ｎａ２ＳｅＯ３质量浓度μｇ／ｍＬ
３０５０６０８０１００１２０
Ｆｘ－１ｕｇ／ｇ７６８１１７２１４６２１９６４２１１５８６２
ｇ／Ｌ４５．９４０．８４０．７３６．８３３．６３１．８
Ｆｘ－２ｕｇ／ｇ７６１１２３９１４１１１９０９２１０７２１２９
ｇ／Ｌ５２．０４７．９４６．６４０．３３９．３３５．５
硒浓度对酵母的影响
Ｆｘ－４ｕｇ／ｇ５４６１０１２１０９６１９１４１２８３１０６２
ｇ／Ｌ５２．８４６．７４６．２４４．１４１．５４２．６
Ｚｘ－４ｕｇ／ｇ７０３７８３９５５１２４８１４８１１７３８
ｇ／Ｌ４９．６４６．５４６．６４４．４４４．４４３．０
Ｚｘ－１０ｕｇ／ｇ１３４８１５２０１５３８１８６２１８３９１９１７
ｇ／Ｌ４８．７４６．３４６．０４５．１４４．３４２．５
Ｚｘ－１３ｕｇ／ｇ１４７６１４０５１８６０２３７８２２０９１９７６
ｇ／Ｌ４４．６３７．０３５．９３２．２３０．７２９．２
含硒量生物量含硒量生物量含硒量生物量含硒量生物量含硒量生物量含硒量生物量
注１：表中含硒量为折合酵母干重后的值。注２：生物量为单位体积培养液中酵母的干重值。
逐渐升高，但当Ｎａ２ＳｅＯ３的浓度增加到某一峰值后，富硒酵母的含硒量开始下降；
ｃ）在相同的条件下，不同的菌株的生物量不同，吸收无机硒的能力也不相同。
综合考虑酵母的生物量和含硒量，从中选出Ｆｘ－２、Ｚｘ－４、Ｚｘ－１０菌株进行下面的实验。２．３通气量对酵母的影响
表４
装液量ｍＬ１００１５０２００２５０３００
含硒量ｕｇ／ｇ１０８４１７１２１８４６１６５９１８００
通气量对酵母的影响Ｆｘ－２
生物量ｇ／Ｌ４６．３４０．２３９．２３８．８３８．５
含硒量ｕｇ／ｇ７０４９９５１０５３１２８２９９１
Ｚｘ－４
生物量ｇ／Ｌ５２．６４８．９４１．５４１．４４０．４
实验结果见表５。
表５说明：在硒浓度不变的情况下，加入硒的时间对酵母硒含量影响较大。加入越早对酵母生长的抑制作用越强，酵母的生物量越低；加硒时间晚，酵母的含硒量较高，在接种后１０ｈ加硒，硒含量最高，之后开始下降，因此，在接种后８ｈ～１０ｈ加硒效果好。
３结论
实验结果见表４。
由表４可看出：菌株的生物量随通气量的增大而增加，硒含量在通气量适宜时较大。２．４加硒时间对酵母的影响
表５
加硒时间
ｈ０２４６８１０１２１４１６
加硒时间对酵母的影响
生物量ｇ／Ｌ４１．２４３．１４４．０４５．０４５．６４５．９４６．９４９．６５４．２
含硒量ｕｇ／ｇ１４２５１５５８１６５２１６６２１７８６１９８１１６０２１４９２１０３４
ａ）在７种碳源中，有４种可以被实验菌株充分利用，但考虑到原料成本因素，故选用蔗糖为富硒酵母培养基碳源。
ｂ）无机硒对酵母的生长繁殖能力影响较大，硒浓度越高，酵母细胞硒含量越大，单达到某一峰值后，开始下降，选用Ｎａ２ＳｅＯ３质量浓度６０μｇ／ｍＬ￣１００μｇ／ｍＬ为佳。
ｃ）在酵母生长的对数期（约８ｈ～１０ｈ）时加硒，选择适宜的通气量，有利于提高酵母的生物量和细胞的硒含量。
参考文献
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