过氧化氢酶产生菌的研究
过氧化氢酶产生菌的研究
摘要：过氧化氢酶一类以过氧化氢为专一底物，通过催化一对电子的转移而最终将其降解为水和氧气的酶。
关键字：过氧化氢酶 发酵调控
过氧化氢酶简介
过氧化氢酶 (Hydrogen peroxide oxidoreductase，catalase EC 1.11.1.6.) 是一类以过氧化氢为专一底物，通过催化一对电子的转移而最终将其降解为水和氧气的酶。研究表明几乎所有的需氧微生物中都存在过氧化氢酶，只有少数好氧菌如过氧化醋杆菌Acetobacter peroxydas 不存在过氧化氢酶。除谢氏丙酸杆菌 Propionibacterium shermanji 和巨大脱硫弧菌 Desulfovibrio gigas 等微生物外，绝大多数厌氧微生物体内不存在过氧化氢酶。根据过氧化氢酶在结构和序列水平上的异同将其划分为 3 个亚群，即单功能过氧化氢酶 (Monofunctional catalase or Typicalcatalase)、双功能过氧化氢酶 (Catalase-peroxidase) 和假过氧化氢酶 (Pseudocatalase or Mn-catalasee)。大多数的过氧化氢酶由 4 个相同的亚单位组成，分子量在 240 kDa 左右，在亚基的活性部位各含一个血红素基团。来自哺乳动物以及某些真菌和细菌的过氧化氢酶还含有 4 个紧密结合的 NADPH 分子。过氧化氢酶可被氰化合物、苯酚类、叠氮化物、过氧化氢、尿素及碱等物质所阻抑。过氧化氢酶主要集中存在于细胞的过氧化物酶体中，另外线粒体和细胞质中也含有少量的过氧化氢酶。过氧化氢酶能及时分解细胞内产生 (主要为 SOD 歧化产物) 或由胞外进入细胞的过氧化氢。避免了过氧化氢通过Fenton 和 Harber-weiss 反应产生·OH 。同时过氧化氢酶还能对血红蛋白及其他含巯基蛋白质起到保护作用，使它们不被氧化。人们研究过氧化氢酶的历史可追溯到 100 多年前，早在 1811 年就已发现动植物组织可以分解过氧化氢产生氧气，到 1892 年 Jacobson 证明了在动植物组织内有专一分解过氧化氢的酶，即过氧化氢酶的存在。1901 年 Loew 第一次报道了过氧化氢酶的生物化学特性。到 1937 年，Sumner 和 Dounce 首次从牛的肝脏中分离得到过氧化氢酶的结晶，这是最早分离得到的高纯度酶之一。随后相继报道了哺乳动物的肝脏、红细胞及大多数微生物体内均含有此酶，其中哺乳动物组织中过氧化氢酶的含量差异很大，肝脏中含量最高，
结缔组织中含量最低，在上述组织细胞内过氧化氢酶主要与细胞器如线粒体和过氧化物酶体结合的形式存在，而在红细胞中则以可溶的状态存在。过氧化氢酶来源丰富，存在于几乎所有好氧生物中和一部分厌氧生物中。动物过氧化氢酶存在于动物的主要组织中，尤以肝与红细胞为最多，脑、心脏与骨骼肌为最少，动物肝脏是过氧化氢酶的一个很大来源，国内外均已实现这一工艺的工业化生产。另外，巴西研究者开发了从人胎盘中提取医用过氧化氢酶的技术。植物方面，主要集中在过氧化氢酶保护植物抗氧化机理方面的研究。不同来源的过氧化氢酶在细胞中的位置有所不同。动物红细胞、肝脏以及细菌的过氧化氢酶存在于细胞质中，必须将细胞破碎才能提取到过氧化氢酶，因此酶的分离、提纯较为复杂。细菌过氧化氢酶的热、碱稳定性虽然可随来源不同而不同，但因为是胞内酶，实现高产和提取均不方便。酵母的过氧化氢酶主要积累于胞内，而一些丝状真菌的过氧化氢酶则主要分泌于胞外，胞内也含有一定量的过氧化氢酶。因此选用嗜热丝状真菌来生产过氧化氢酶在应用和产品提取方面具有较大优势。此外也有研究通过构建基因工程菌来生产过氧化氢酶。目前商业化的过氧化氢酶以动植物提取和微生物发酵生产为主，本文将重点讨论微生物来源的过氧化氢酶的生产。自 20 世纪 80 年代以来，织物和纸张的生产者以及其他工业就已经开始使用过氧化氢代替有毒的氯气来漂白和消毒产品。过氧化氢可用于消除新鲜水果和蔬菜上有害的细菌，如沙门氏菌和大肠杆菌，还可用于消毒奶制品，为食品的纸包装如果汁盒消毒也不必冷藏储存等。在去除生产过程中剩余的过氧化氢的过程中，人们将注意力转向了具有非常高的催化效率的过氧化氢酶，因此过氧化氢酶在食品、医药、临床等行业都有着广泛的用途。目前过氧化氢酶主要的应用领域包括：1) 临床。在临床分析中，过氧化氢酶对研究自由基代谢失衡、抗衰老和肿瘤发病机理具有一定价值，对某些疾病的诊断、鉴别诊断亦具有重要意义[12,14]。过氧化氢酶可消除过氧化氢，对超氧化物歧化酶起保护作用，因而具有抗衰老作用[15]。2) 医药。由于过氧化氢具杀菌、清洁、漂白及消毒的功效，常用于器械消毒。如在隐形眼镜消毒过程中添加过氧化氢酶可分解消毒液中残留的过氧化氢。国内、外均有研究的专利发表[16-18]。3) 食品加工。过氧化氢酶可使食品保鲜，并作为消除啤酒、饮料中分子氧、活性氧和自由基的抗氧化剂。此外过氧化氢酶可与葡萄糖氧化酶并用作为氧的去除剂，还可用于牛乳杀菌及干酪原料乳的杀菌[19]。4) 其他工业。与过氧化氢同时使用，用于橡胶成型、塑料及多泡性粘合剂。纸浆、纤维、毛漂白工艺中除残留的过氧化氢。加入化妆品中可防止皮肤衰老，还可处理半导体
废水。近年来随着过氧化氢在纺织、造纸、制浆等行业的普遍应用，市场对过氧化氢酶的需求也呈大幅增长趋势。
PH 对酶活力的影响
在25℃的测活体系中, 改变不同的pH 值, 研究pH 值对酶催化底物H2O2水解活力的影响将等量的酶液与不同pH 值的缓冲液等量混合, 室温下放置30min 后, 然后取出10μL处理的酶液正常的测活体系(25℃,pH7.0) 中检测酶的剩余活力, 结果表明pH 对酶的碱稳定性范围较宽, 在pH7~14区域较稳定。
温度对酶活力的影响
粗酶在不同温度下(30~100℃) 的50mm 的磷酸缓冲(PH7.0)热处理10min 后, 迅速冷却到室温, 然后取出10μL处理的酶液在正常的测活体系(25℃,pH7.0）表明酶在85℃以下热处理30min, 酶活力基本保持不变, 在8 5℃以上酶活力开始下降, 随着处理的温度升高, 酶活力呈快速下降. 实验说明酶在85℃以内都具有较好的热稳定性. 高于85 ℃, 酶极不稳定。
过氧化氢酶的应用
食品工业：半个世纪以前CAT 就开始应用于食品工业。利用 C A T 能分解 H 2 O2 产生 O2 的性质, 可在烘烤食品制造过程中将 C A T 和过氧化氢一起用作疏松剂。但 C A T 更广泛的应用是对牛奶等的消毒。在牛奶保存或奶酪制造前用过氧化氢对牛奶或液体鸡蛋制品进行消毒, 然后用 CAT 去除残余的过氧化氢。这一过程可以在低温下进行, 从而避免高温处理造成的蛋白质变性和某些营养物质的破坏。
环保行业：目前发达国家环保行业的过氧化氢消费量约占过氧化氢总消费量的 10 % ~ 15 %。用 CAT 取代化学试剂降解工业废水中含有的 H 2 O2 可以避免二次污染, 同时也可以降解芳环化合物和脂族化合物。其中辣根过氧化氢酶( H RP) 由于价格便宜且失活慢, 已在很多含酚废水处理中得到了应用。
造纸工业：近年来造纸行业相继以H2O2漂白代替传统漂白方法, 并通常用SO2和亚硫酸氢钠去除漂白后的H2O2。随着世界各国对环境和安全问题的考虑, 促进了去除H2 O2方法的深入研究, 有研究表明, CAT可在
10min 内将 H2O2降解, 在这个领域具有广阔的用前景。2004 年美国能源部的爱达荷国家工程和环境实验室的研究者们分离并生产了一种过氧化氢酶产品( 命名为超稳定过氧化氢酶) , 可应用于纺织和造纸行业的漂白过程, 该项工作被评为 200 4 年 100 个最显著的技术成果之一。 纺织行业：在印染加工过程中, 传统的去除过氧化氢的工艺有两种, 一为织物经漂白后用大量热水、冷水反复清洗( 至少应洗 3 次) 再进行染色; 二为织物经漂白后用还原剂还原, 再用水清洗一遍后进行染色。而应用过氧化氢酶可快速去除过氧化氢, 只需要冷洗一遍, 甚至不用水洗, 并可以与染色工艺同浴。该方法可节约用水及能源、缩短工艺时间、实现安全染色、减少布面磨损, 并有利于保护环境。
工业酶催化：在许多氧化酶的催化过程中会生成H2O2的副产物, 而H2O2往往会对底物、产物或酶造成降解, 因此, 过氧化氢酶能快速分解 H2O2的性质使其在工业酶催化中也有重要的应用。例如, 在利用乙醇酸氧化酶催化乙醇酸生产乙醛酸的过程中, 由于副产物H2O2容易导致产物乙醛酸的降解和酶的失活, 人们通常采用乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶的双酶催化体系, 使催化过程能够顺利进行, 并保持较高的产率。
菌种来源
微生物过氧化氢酶的野生菌株生产
微生物过氧化氢酶发酵研究最早可追溯到 1951年，Brizuela 等首次报道了用杆菌 Bacillus 发酵生产过氧化氢酶。后来，研究者不断筛选出新的过氧化氢酶生产菌株，同时发展出各种优化发酵过程的方法。由于过氧化氢酶在微生物中普遍存在，生物多样性赋予了微生物多种可能的过氧化氢酶合成、分泌和调控机制，因此通过菌种筛选提高发酵水平是一种十分有效手段。目前为止，至少筛选出8 种产过氧化氢酶的微生物，如变幻青霉 Penicillumvariabile 、 黑 曲 Aspergillus niger、 酿 酒 酵 母Saccharomyces cereisiae 、葡萄球菌 Staphylococcus 、溶壁微球菌 Micrococcus lysodeiktious、嗜热囊菌Thermoascus aurantiacus、枯草芽胞杆菌 Bacillus
subtilis 、放射型根瘤菌 Rhizobium radiobacte 等 (表1) 。目前最高的过氧化氢酶发酵水平是在枯草杆菌中获得的，最高产量达到 18 000 U/mL，生产强度可以达到 1 000 U/(mL·h)[21]。除菌种筛选外，培养条件优化 (pH、温度、溶氧等) 和培养基优化等手段也运用到微生物过
氧化氢酶的发酵中，过氧化氢酶的发酵水平不断提高赵志军等通过培养基优化，使过氧化氢酶产量从 30 U/mL 提高到 3 258 U/mL[23]。邓宇等通过氮源优化，使酶活从 3 000 U/mL 提高到11 000 U/mL[22]。经过 50 多年的努力，研究者将过氧化氢酶的发酵水平从78 U/mL提高到18 000 U/(mL·h) ，生产强度从 0.1 U/(mL·h) 提高到 1 000 U/(mL·h) 。但随着菌种筛选工作的不断开展，从自然界直接筛选获得产酶水平大幅提升的微生物的几率越来越小，这就要求研究者通过基因工程手段定向的构建能够高产过氧化氢酶的微生物。
基因工程菌构建
为了进一步提高微生物过氧化氢酶的产量，研究者尝试构建基因工程菌来高效生产过氧化氢酶。Furuta 等在 1990 年首次报道了以大肠杆菌为宿主构建产过氧化氢酶的基因工程菌，基因来源是小鼠肝脏细胞，但获得的产量不高[31]。接下来科学家尝试了各种来源的过氧化氢酶基因和表达宿主 。到目前为止，毕赤酵母 Pichia pastoris 、结核分枝杆菌 Mycobacterium tuberculosis 、多 形 汉 逊 酵 母Hansenula polymorpha 、 枯 草 芽 胞 杆 菌 Bacillussubtilis 等已作为生产基因工程过氧化氢酶的宿主，过 氧 化 氢 酶 基 因 的 来 源 也 拓 展 到 稻 瘟 病 菌Magnaporthe grisea、枯草芽胞杆菌 Bacillus subtilis、嗜冷杆菌 Psychrobacte 、人体细胞、嗜热脂肪芽胞杆 菌Bacillus stearothermophilus 、 酿 酒 酵 母Saccharomyces cerevisiae 等来源。 菌种选育
菌株的初筛
将部分样品溶于100 mL水中，分别稀释获得浓度为10～，10～，10_5(w／V) 的样品溶液，分别移取200pL 涂布于初筛培养基平板上，25℃倒置培养24h 后，挑取菌落一小部分涂布于滴有H ：O 。的载玻片上，若没有气泡产生，则过氧化氢酶反应试验为阴性；若有气泡产生，则过氧化氢酶反应试验为阳性，挑选该菌落进行复筛。
菌株的复筛
将经过初筛得到的菌落分别接种于20 mL 种子培养基，25℃，200 r ／min 摇床培养24 h后离心，取菌液2 mL，并用蒸馏水稀释至10 mL备用。将稀释的菌液离心并收集菌体，以pH 7．0，0．2 mmol／L 磷酸盐缓冲液重悬菌体，并在冰浴中超声破碎，离心后取上清测过氧化氢酶活性。
优化发酵
过氧化氢酶与胁迫物的关系及诱导产酶过氧化氢酶可由过氧化氢等诱导物诱导表达[1,38-40]。表 3 列出了几种典型微生物在过氧化氢和O2−胁迫下抗氧化物酶的表达情况。可以看出，过氧化氢酶是各种微生物细胞 (特别是对于 Bacillus 属的微生物) 抵抗活性氧胁迫最主要的抗氧化物酶由于活性氧消耗了胞内的还原力，因此在活性氧胁迫下六磷酸葡萄糖脱氢酶 (Glucose-6-phosphate-dehydrogenase，G6PD) 的活性也得到了提高G6PD 的作用是提供维持细胞内氧化还原环境平衡的还原力 NADPH 。在微生物氧化应激研究中，还发现一些新表达的蛋白，其生理作用目前还不是很清楚，但从已经确定的来看，大多是一些控制抗氧化酶转录和表达的调控因子[21,42]。过氧化氢酶作为微生物体内专一清除过氧化氢的抗氧化物酶，其合成受到底物 (过氧化氢) 的直接诱导。已有的研究表明，过氧化氢对过氧化氢酶诱导作用主要取决于其浓度，一般来说，低浓度过氧化氢诱导过氧化氢酶合成，过氧化氢酶立即分解过氧化氢，以消除过氧化氢对细胞的继续毒害，同时提高了细胞对过氧化氢胁迫的抵抗能力[46]。但当过氧化氢浓度超过过氧化氢酶的分解能力或过氧化氢酶来不及分解过氧化氢时，过氧化氢及其产物 OH ·会不加选择地攻击细胞成分，引起细胞代谢紊乱，抑制细胞生长，导致过氧化氢酶合成水平低。更为重要的是 OH ·本身会直接攻击过氧化氢酶活性中心导致过氧化氢酶失活，破坏细胞的防御系统，加剧氧自由基对细胞的氧化损伤[47]。另外，过氧化氢对过氧化氢酶合成的诱导作用还取决于胁迫方式，Janero 等发现连续添加非致死浓度的过氧化氢能够刺激肌原细胞 (Cardiacmyocytes) 过氧化氢酶的合成，而一次性添加较高浓度 (25 µmol/L) 的过氧化氢却不能诱导过氧化氢酶合成[48]。由于 O2−诱导超氧化物歧化酶合成的同时会产生过氧化氢，因此在 O2−胁迫下过氧化氢酶也会有不同程度的提高[4,40]。另有研究表明，一些环境因素如温度、盐胁迫也能够诱发胞内 O2−的产生从而提高过氧化氢酶合成水平。Bai 等发现在黑曲霉 Aspergillusniger 生长的对数期或稳定期提高培养温度 (25℃~35℃) ，胞内活性氧浓度增加了 1.3 倍和 2.8 倍，从而诱导了过氧化氢酶合成[49]。过氧化氢胁迫对过氧化氢酶合成的影响除了与微生物种类、过氧化氢浓度和胁迫方式有关外，还与细胞生理状态 (不同生长时期) 、营养环境条件等因素相关[50]。表 4 列举了通过诱导或胁迫促进野生菌发酵生产过氧化氢酶的方法。例如，姚丹丹等使用枯草芽胞杆菌作为生产菌株，通过过氧化氢和乙醇诱导，使过氧化氢酶产
量从 11 000 U/mL 提高到 23 000 U/mL，生产强度从 360 U/(mL·h) 提高到 640 U/(mL·h)[51]。可见，通过添加活性氧、过氧化氢、甲醇等物质进行诱导或胁迫产酶，对过氧化氢酶野生菌而言是一种十分有效的提高微生物产量的方法。此外，过氧化氢酶的胁迫机制也提醒我们，基因工程菌中过量表达的过氧化氢酶可能会影响到宿主菌自身对环境氧胁迫的响应。例如过量合成的过氧化氢酶会降低宿主细胞的氧胁迫水平，这时如果通过发酵控制提高环境的溶氧水平，将在不伤害细胞的前提下促进生长和代谢速率。
未来展望
过氧化氢酶发酵生产目前的研究主要集中在菌种筛选、培养基和发酵条件优化、基因工程菌构建等方面，发酵水平仍需进一步提高。考虑到纺织加工处理的条件需要，需要开发出更加适应高温和碱性条件的过氧化氢酶用于过氧化氢漂白后的酶处理。因此，未来的研究重点将围绕以下几个方面进行：1) 通过菌种筛选，获取高产和能耐受高 pH 、高温度的过氧化氢酶的菌株。通过野生菌发酵过程控制与优化，提高发酵产量。同时对编码耐高温、高碱过氧化氢酶的基因进行鉴定。2) 从耐高温高碱过氧化氢酶基因出发构建工程菌，结合现代在线控制与分析技术，进行过氧化氢酶发酵过程优化与控制研究，提高产酶水平。3) 通过定点突变、定向进化等分子改造手段，提高过氧化氢酶的温度、pH 耐受性，提高应用性能。
未来的研究重点将围绕以下几个方面进行：1) 通过菌种筛选，获取高产和能耐受高 pH 、高温度的过氧化氢酶的菌株。通过野生菌发酵过程制与优化，提高发酵产量。同时对编码耐高温、高碱过氧化氢酶的基因进行鉴定。2) 从耐高温高碱过氧化氢酶基因出发构建工程菌，结合现代在线控制与分析技术，进行过氧化氢酶发酵过程优化与控制研究，提高产酶水平。3) 通过定点突变、定向进化等分子改造手段，提高过氧化氢的温度、pH 耐受性，提高其应用性能。