检验方法验证.检验方法确认实例(2010年版GMP)

检验方法确认报告

目 录

1. 概述

2. 确认目的和范围 3. 组织及职责 4. 确认起止日期

5. 方法确认所需要的仪器设备及相关文件的确认 6. 方法确认所需要的对照品、原辅料、检验样品的确认 7. 确认项目和确认方法、确认结果

7.1【鉴别（1）】人工牛黄薄层色谱鉴别方法确认 7.2【鉴别（2）】甲硝唑紫外光谱鉴别方法确认 7.3【鉴别（3）】人工牛黄胆红素液相色谱鉴别方法确认 7.4甲硝唑含量测定方法专属性确认

7.5甲硝唑含量测定方法线性关系与线性范围确认 7.6甲硝唑含量测定方法准确度确认 7.7甲硝唑含量测定方法精密度确认 7.8甲硝唑含量测定方法耐用性确认 7.9胆红素含量测定方法系统适用性确认 7.10胆红素含量测定方法专属性确认

7.11胆红素含量测定方法线性关系与线性范围确认 7.12胆红素含量测定方法准确度确认 7.13胆红素含量测定方法精密度确认 7.14胆红素含量测定方法耐用性确认 8. 三批产品按本检验方法检验的结果确认 9. 偏差与漏项控制 10. 确认报告会审

1. 概述

我公司生产的品种人工牛黄甲硝唑胶囊，执行国家药监局颁布的法定药品标准，标准号为：WS-10001-(HD-0204)-2002。本公司前身（原广东华卫药业有限公司）按该标准生产、检验人工牛黄甲硝唑胶囊已有多年的历史。

根据GMP （2010版）第二百二十三条规定，对收入药典和其它法定标准的分析方法，应通过检验方法确认来证明该方法在本实验室条件下的适用性。故本公司依照法定标准WS-10001-(HD-0204)-2002以及《中国药典》2015版四部附录9101：药品质量标准分析方法验证指导原则的规定，制定本检验方法确认方案，由质量部按制定的方法进行试验，根据试验结果判断检验方法在本公司是否适用。

本产品的微生物限度检查方法验证，另行制定验证方案进行验证，不包括在本次确认。 2. 确认目的和范围

确认该产品的检验方法在本公司检验室的适用性，保证检验结果的可靠性。

本确认方案采用3批按GMP 要求组织生产的人工牛黄甲硝唑胶囊，进行检验方法的确认。确认项目包括【鉴别】、【甲硝唑含量测定】、【胆红素含量测定】等。 3. 组织及职责

3.1确认方案和确认报告的起草、审核、批准

确认方案由质量部QC 组负责起草，由质量部审核，最终由质量负责人批准。确认方案实施完成后，由QC 组负责汇总各个项目确认的结果、撰写报告，由质量部审核，最终由质量负责人批准报告。

3.2确认方案的培训

确认方案在经质量负责人批准后，由QC 组组长对本次确认实施的相关人员组织培训工作，并将该次的培训记录归档。

3.3确认方案实施过程中的变更和偏差

确认方案实施过程中如有变更和偏差，质量负责人应当组织进行评估并采取相应的控制措施。 3.4 确认工作小组成员表

用于本次检验方法确认的三批产品是人工牛黄甲硝唑胶囊

批号： 、 、

实施确认工作的起止时间是： ～

5. 方法确认所需要的仪器设备及相关文件的确认 5.1. 主要检验仪器设备确认表

检查人/日期： 复核人/日期： 5.2. 确认所需文件的确认表

检查人/日期： 复核人/日期：

6. 方法确认所需要的对照品、原辅料、检验样品的确认 6.1. 对照品、原辅料检查表

检查人/日期： 复核人/日期： 6.2. 检验样品确认表

检查人/日期： 复核人/日期：

7. 确认项目及确认方法

7.1【鉴别（1）】人工牛黄薄层色谱鉴别方法确认 7.1.1鉴别方法的专属性确认方法：

参照人工牛黄甲硝唑胶囊质量标准WS-10001-(HD-0204)-2002【鉴别（1）】项下规定，分别制备以下溶液，进行鉴别方法专属性的确认：

（1）胆酸、猪去氧胆酸对照品溶液：取胆酸、猪去氧胆酸对照品，加乙醇制成每1ml 各含0.5mg 的溶液，作为对照品溶液；

（2）3批人工牛黄甲硝唑胶囊成品溶液：分别取本品3批的内容物约0.95g （约相当于人工牛黄20mg ），研细，加氯仿15ml ，超声处理20分钟，滤过，滤液置水浴上蒸干，残渣加乙醇2ml 使溶解，作为供试品溶液；

外，称取甲硝唑原料0.80g ，淀粉0.08g ，二氧化硅0.04g 共置量瓶中，加氯仿15ml ，超声处理20分钟，滤过，滤液置水浴上蒸干，残渣加乙醇2ml 使溶解，作为人工牛黄阴性样品溶液。

试验方法：

照薄层色谱法（中国药典2015年版四部0502）试验，吸取上述溶液各4µl,分别点于同一硅胶G 薄层板上，以正己烷-醋酸乙酯-醋酸-甲醇（20：25：2：3）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热数分钟至斑点显色清晰，日光下或置紫外光灯（365nm ）下检视。

7.1.2方法确认接受标准：

（1）胆酸、猪去氧胆酸对照品溶液：显2个主斑点；

（2）3批人工牛黄甲硝唑胶囊成品溶液：在与对照品色谱相应位置上，显同颜色斑点； （3）人工牛黄阴性样品溶液：在与对照品色谱相应位置上，不显斑点。 7.1.3方法确认记录与确认结果

（1）电子天平 型号 编号 ， 数显鼓风干燥箱型号 编号 硅胶G 薄层板批号 ，来源 （2）胆酸对照品称样量 ，稀释倍数 猪去氧胆酸对照品称样量 ，稀释倍数 （3）人工牛黄甲硝唑胶囊内容物称样量：

批号 ，称样量 ；批号 ，称样量 ；批号 ，称样量 ； （4）项目确认结果

【鉴别（1）】人工牛黄薄层色谱鉴别---方法专属性确认结果

检查人/日期： 复核人/日期： 7.2【鉴别（2）】甲硝唑紫外光谱鉴别方法确认 7.2.1鉴别方法的专属性确认方法：

参照人工牛黄甲硝唑胶囊质量标准WS-10001-(HD-0204)-2002【鉴别（2）】项下规定，分别制备以下溶液，进行鉴别方法专属性的确认：

（1）甲硝唑对照品溶液：取甲硝唑对照品约20.0mg ，精密称定，置100ml 量瓶中，加盐酸溶液（9→1000）溶解，稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml 置100ml 量瓶中，加盐酸溶液（9→1000）稀释至刻度，摇匀即得。

（2）3批人工牛黄甲硝唑胶囊成品溶液：分别精密取本品3批的内容物约59mg （约相当于甲硝唑50mg ），置100ml 量瓶中，加盐酸溶液（9→1000）约80ml ，微温使甲硝唑溶解，加盐酸溶液（9→1000）稀释至刻度，摇匀，用干燥滤纸滤过，精密量取续滤液5ml ，置200ml 量瓶中，加盐酸溶液（9→1000）稀释至刻度，摇匀即得。

称取淀粉10mg ，二氧化硅5mg 、人工牛黄3mg 置200ml 量瓶中，加盐酸溶液（9→1000）160ml 微温，放冷后稀释至刻度，摇匀，用干燥滤纸滤过，精密量取续滤液5ml ，置200ml 量瓶中，加盐酸溶液（9→1000）稀释至刻度，摇匀即得。

试验方法：

照分光光度法，取上述各种溶液扫描紫外吸收光谱 7.2.2方法确认接受标准：（1）甲硝唑对照品溶液：在277±2nm 的波长处有最大吸收；在241±2nm 的波长处有最小吸收；

（2）3批人工牛黄甲硝唑胶囊成品溶液：在277±2nm 的波长处有最大吸收；在241±2nm 的波

长处有最小吸收；

（3）甲硝唑阴性样品溶液：在277±2nm 的波长处无最大吸收；在241±2nm 的波长处无最小

吸收。

7.2.3方法确认记录与确认结果

（1）电子天平 型号 编号 ，紫外分光光度计型号 编号 （2）甲硝唑对照品称样量20.1 mg （3）人工牛黄甲硝唑胶囊内容物称样量：

批号 ，称样量 ；批号 ，称样量 ；批号 ，称样量 ； （4）项目确认结果

【鉴别（2）】甲硝唑紫外光谱鉴别---方法专属性确认结果

检查人/日期： 复核人/日期 7.3【鉴别（3）】人工牛黄胆红素液相色谱鉴别方法确认 7.3.1鉴别方法的专属性确认方法：

参照人工牛黄甲硝唑胶囊质量标准WS-10001-(HD-0204)-2002【鉴别（3）】项下规定，分别制备以下溶液，进行鉴别方法专属性的确认：

（1）胆红素对照品溶液：取胆红素对照品约10.0mg ，精密称定，置100ml 量瓶中，加氯仿溶解，定容至刻度，摇匀，精密量取1.0ml 置25ml 棕色量瓶中, 加氯仿-甲醇-水-盐酸(90：10：0.3：0.03) 混合液稀释至刻度，制成每1ml 中含胆红素约4μg 的溶液，即得。

（2）样品提取溶剂：氯仿-甲醇-水-盐酸（90：10:0.3:0.03）的混合液

（3）人工牛黄甲硝唑胶囊成品溶液：取20151201批本品的内容物约1.7g （约相当于胆红素0.2mg ），精密称定，置50ml 棕色量瓶中，加氯仿-甲醇-水-盐酸（90：10:0.3:0.03）混合液约40ml ，超声提取15分钟，取出，迅速冷却至室温，加上述溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。。

（4）人工牛黄阴性样品溶液：按照人工牛黄甲硝唑胶囊工艺处方的比例，除人工牛黄不称取外，称取甲硝唑1.45g ，淀粉0.145g ，二氧化硅0.072g 共置50ml 棕色量瓶中，加氯仿-甲醇-10%

盐酸（50：50:0.3）混合液约40ml ，超声提取15分钟，取出，冷却至室温，加上述溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

试验方法：

精密吸取上述溶液各20μl ，注入液相色谱仪，记录色谱图。

7.3.2方法确认接受标准：（1）人工牛黄甲硝唑胶囊成品溶液主峰保留时间与胆红素对照品溶液主峰保留时间一致（相对偏差不超过0.5%）；

（2）人工牛黄阴性样品溶液、样品提取溶剂在胆红素峰保留时间处均应为平直基线，无吸收峰。 7.3.3方法确认记录与确认结果

（1）电子天平 型号 编号 ，高效液相色谱仪型号 编号 （2）胆红素对照品称样量：9.90mg （3）人工牛黄甲硝唑胶囊内容物称样量： 批号 20151201 ，称样量 （4）项目确认结果

【鉴别（3）】人工牛黄胆红素液相色谱鉴别---方法专属性确认结果

检查人/日期： 复核人/日期 7.4甲硝唑含量测定方法专属性确认

7.4.1甲硝唑含量测定方法的专属性确认方法：

参照人工牛黄甲硝唑胶囊质量标准WS-10001-(HD-0204)-2002【含量测定 甲硝唑】项下规定，分别制备以下溶液，进行方法专属性的确认：

（1）甲硝唑对照品溶液：取甲硝唑对照品约20.0mg ，精密称定，置100ml 量瓶中，加盐酸溶液（9→1000）溶解，稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml 置100ml 量瓶中，加盐酸溶液（9→1000）稀释至刻度，摇匀即得。

（2）3批人工牛黄甲硝唑胶囊成品溶液：分别精密取本品3批的内容物约59mg （约相当于甲硝唑50mg ），置100ml 量瓶中，加盐酸溶液（9→1000）约80ml ，微温使甲硝唑溶解，加盐酸溶液（9→1000）稀释至刻度，摇匀，用干燥滤纸滤过，精密量取续滤液5ml ，置200ml 量瓶中，加盐酸溶液（9→1000）稀释至刻度，摇匀即得。

（3）甲硝唑阴性样品溶液：按照人工牛黄甲硝唑胶囊工艺处方的比例，除甲硝唑不称取外，称取淀粉10mg ，二氧化硅5mg 、人工牛黄3mg 置200ml 量瓶中，加盐酸溶液（9→1000）160ml 微温，放冷后稀释至刻度，摇匀，用干燥滤纸滤过，精密量取续滤液5ml ，置200ml 量瓶中，加盐酸溶液（9→1000）稀释至刻度，摇匀即得。

试验方法：

照分光光度法，取上述各种溶液扫描紫外吸收光谱，并读取吸收峰处的吸收度。 7.4.2方法确认接受标准：（1）甲硝唑对照品溶液：在277±2nm 的波长处有最大吸收； （2）3批人工牛黄甲硝唑胶囊成品溶液：在277±2nm 的波长处有最大吸收；

（3）甲硝唑阴性样品溶液：在277±2nm 的波长处基本无吸收，吸收度A 值接近0。 7.4.3方法确认记录与确认结果

（1）电子天平 型号 编号 ，紫外分光光度计型号 编号 （2）甲硝唑对照品称样量20.1 mg （3）人工牛黄甲硝唑胶囊内容物称样量：

批号 ，称样量 ；批号 ，称样量 ；批号 ，称样量 ； （4）项目确认结果

甲硝唑含量测定---方法专属性确认结果

检查人/日期： 复核人/日期 7.5甲硝唑含量测定方法的线性关系与线性范围确认 7.5.1甲硝唑含量测定方法的线性关系与线性范围确认方法：

参照人工牛黄甲硝唑胶囊质量标准WS-10001-(HD-0204)-2002【含量测定 甲硝唑】项下规定，分别制备以下溶液，进行线性关系与线性范围的确认：

（1）甲硝唑对照品贮备液：取甲硝唑对照品约20.0mg ，精密称定，置100ml 量瓶中，加盐酸溶液（9→1000）溶解，稀释至刻度，摇匀。精密量取6ml 置100ml 量瓶中，加盐酸溶液（9→1000）稀释至刻度，摇匀即得。

（2）线性关系测试溶液：分别精密量取甲硝唑对照品贮备液4ml 、5ml 、6ml 、7ml 、10ml 置100ml 量瓶中，加盐酸溶液（9→1000）稀释至刻度，摇匀得系列浓度的测试溶液。

试验方法：照紫外-可见分光光度法，在277nm 的波长处测定上述系列溶液的吸收度。计算出各个测试溶液的甲硝唑浓度，以浓度为横坐标，吸收度为纵坐标，计算线性回归方程、回归系数R 、线性范围。

7.5.2方法确认接受标准：（1）测试溶液的甲硝唑浓度与吸收度之间呈良好线性关系，回归系数R ：0.995≤R ≤1；

（2）甲硝唑浓度线性范围：应涵盖人工牛黄甲硝唑胶囊质量标准WS-10001-(HD-0204)-2002【含量测定 甲硝唑】项下样品溶液中甲硝唑浓度12.5μg/ml的80%～120%，即结果的线性范围应涵盖10.0μg/ml～15.0μg/ml。 7.5.3方法确认记录与确认结果

（1）电子天平 型号 编号 ，紫外分光光度计型号 编号 （2）甲硝唑对照品称样量20.1 mg （3）项目确认结果

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甲硝唑含量测定方法-----线性关系与线性范围确认

检查人/日期： 复核人/日期 7.6甲硝唑含量测定方法准确度确认（回收率试验） 7.6.1甲硝唑含量测定方法的准确度确认方法：

参照人工牛黄甲硝唑胶囊质量标准WS-10001-(HD-0204)-2002【含量测定 甲硝唑】项下规定，分别制备以下溶液，进行方法准确度的确认：

（1）甲硝唑阴性样品溶液：按照人工牛黄甲硝唑胶囊工艺处方的比例，精密称取人工牛黄25.0mg ，淀粉100.0mg ，二氧化硅50.0mg 共置100ml 量瓶中，加盐酸溶液（9→1000）稀释至刻度，摇匀即得。

（2）回收率测试溶液：精密称取甲硝唑工作对照品约50mg ，置100ml 量瓶中，精密加入甲硝

唑阴性样品溶液5ml ，再加盐酸溶液（9→1000）约75ml ，微温使甲硝唑溶解，加盐酸溶液（9→1000）稀释至刻度，摇匀，用干燥滤纸滤过，精密量取续滤液5ml ，置200ml 量瓶中，加盐酸溶液（9→1000）稀释至刻度，摇匀，照分光光度法，在277nm 的波长处测定吸收度，按C 6H 9N 3O 3的吸收系数为377计算甲硝唑加入量，计算加样回收率。

（3）甲硝唑工作对照品：采用依照中国药典2015年版“甲硝唑”项下进行全检合格，标定纯度的甲硝唑原料药。

7.6.2方法确认接受标准：

A×40

（1）计算公式：工作对照品回收率%=—————×100% 377×W R

式中：A 为回收率测试溶液的吸收度；

WR 为工作对照品加入量（g ）

（2）工作对照品回收率限度为99.0%～101.0%，回收率的相对标准偏差（RSD ）限度为2.0% 7.6.3方法确认记录与确认结果

（1）电子天平 型号 编号 ，紫外分光光度计型号 编号 （2）甲硝唑工作对照品（湖北省宏源药业科技股份有限公司，批号：[1**********]，标定结果纯度为100.0%）。 （3）项目确认结果

甲硝唑含量测定方法-----准确度确认结果

检查人/日期： 复核人/日期 7.7甲硝唑含量测定方法精密度确认

7.7.1甲硝唑含量测定方法的精密度确认方法：

参照人工牛黄甲硝唑胶囊质量标准WS-10001-(HD-0204)-2002【含量测定 甲硝唑】项下方法，进行方法精密度的确认：

（1）人工牛黄甲硝唑胶囊成品甲硝唑含量测定溶液：精密取本品20151201批成品的内容物约59mg （约相当于甲硝唑50mg ），置100ml 量瓶中，加盐酸溶液（9→1000）约80ml ，微温使甲硝唑溶解，加盐酸溶液（9→1000）稀释至刻度，摇匀，用干燥滤纸滤过，精密量取续滤液5ml ，置200ml 量瓶中，加盐酸溶液（9→1000）稀释至刻度，摇匀, 照分光光度法，在277nm 的波长处测定吸收度，按C 6H 9N 3O 3的吸收系数为377计算甲硝唑含量。

（2）仪器吸收度读数重复性：取同一份含量测定溶液, 在紫外分光光度上连续测定吸收度。 （3）甲硝唑含量测定的重复性：取20151201批成品，由同一人分别称取6份样品，进行含量

测定。

（4）甲硝唑含量测定的中间精密度：取20151201批成品，由甲实验人员称取6份样品，进行测定（即上述甲硝唑含量测定的重复性）；再由乙实验人员在不同的日期称取6份样品，进行测定。 7.7.2方法确认接受标准：

A×40

（1）计算公式：甲硝唑的绝对百分含量%=—————×100% 377×W

式中：A 为溶液的吸收度；

W为样品称样量（g ）

（2）仪器吸收度读数重复性：读数的相对标准偏差（RSD ）限度为0.3% （3）甲硝唑含量测定的重复性：结果的相对标准偏差（RSD ）限度为1.5% （4）甲硝唑含量测定的中间精密度：结果的相对标准偏差（RSD ）限度为2.0% 7.7.3方法确认记录与确认结果

（1）电子天平 型号 编号 ，紫外分光光度计型号 编号 （2）仪器吸收度读数重复性：同一份溶液读数6次，结果如下：

检查人/日期： 复核人/日期 （3）甲硝唑含量测定的重复性：成品批号20151201

检查人/日期： 复核人/日期：

佛山市华普生药业有限公司

（4）甲硝唑含量测定的中间精密度 成品批号20151201

检查人/日期： 复核人/日期：

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7.8甲硝唑含量测定方法耐用性确认

将7.2项下成品溶液、对照品溶液放置于室温，每隔一段时间测定吸收度，吸收度至少应在8小时内稳定。

甲硝唑含量测定---方法耐用性确认

检查人/日期： 复核人/日期： 7.9胆红素含量测定方法系统适用性确认 7.9.1胆红素含量测定方法系统适用性确认方法

参照人工牛黄甲硝唑胶囊质量标准WS-10001-(HD-0204)-2002【含量测定 胆红素】项下方法，进行高效液相色谱系统适用性确认：

（1）人工牛黄甲硝唑胶囊成品胆红素含量测定溶液：精密称取批号20151201的人工牛黄甲硝唑胶囊内容物约1.7g （约相当于胆红素0.2mg ），置50ml 棕色量瓶中，加氯仿-甲醇-水-盐酸（90：10:0.3:0.03）混合液约40ml ，超声提取15分钟，取出，迅速冷却至室温，加上述溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

（2）色谱条件：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相为甲醇-氯仿-1%磷酸溶液（81:13:6），检测波长449nm 。

（3）取上述同一份含量测定溶液, 连续6次进样测定，每次进样量均为20μl ，记录色谱图。 7.9.2胆红素含量测定方法系统适用性确认接受标准

（1）主峰（胆红素峰）保留时间的相对标准偏差（RSD ）限度为1.0% （3）主峰（胆红素峰）面积的相对标准偏差（RSD ）限度为2.0% （4）主峰（胆红素峰）的理论板数应大于1500 （5）主峰（胆红素峰）的分离度应大于1.5

（6）主峰（胆红素峰）的拖尾因子应在0.9～1.1之间 7.9.3方法确认记录与确认结果

（1）电子天平 型号 编号 ，高效液相色谱仪型号 编号 （2）系统适用性确认结果如下：

检查人/日期： 复核人/日期 7.10胆红素含量测定方法专属性确认

7.10.1胆红素含量测定方法的专属性确认方法：

参照人工牛黄甲硝唑胶囊质量标准WS-10001-(HD-0204)-2002【含量测定 胆红素】项下规定，分别制备以下溶液，进行含量测定方法专属性的确认：

（1）胆红素对照品溶液：取胆红素对照品约10.0mg ，精密称定，置100ml 量瓶中，加氯仿溶解，定容至刻度，摇匀，精密量取1.0ml 置25ml 棕色量瓶中, 加氯仿-甲醇-水-盐酸(90：10：0.3：0.03) 混合液稀释至刻度，制成每1ml 中含胆红素约4μg 的溶液，即得。

（2）样品提取溶剂：氯仿-甲醇-水-盐酸（90：10:0.3:0.03）的混合液

（3）人工牛黄甲硝唑胶囊成品溶液：取20151201批本品的内容物约1.7g （约相当于胆红素0.2mg ），精密称定，置50ml 棕色量瓶中，加氯仿-甲醇-水-盐酸（90：10:0.3:0.03）混合液约40ml ，超声提取15分钟，取出，迅速冷却至室温，加上述溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。。

（4）人工牛黄阴性样品溶液：按照人工牛黄甲硝唑胶囊工艺处方的比例，除人工牛黄不称取外，称取甲硝唑1.45g ，淀粉0.145g ，二氧化硅0.072g 共置50ml 棕色量瓶中，加氯仿-甲醇-10%盐酸（50：50:0.3）混合液约40ml ，超声提取15分钟，取出，冷却至室温，加上述溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

试验方法：

精密吸取上述溶液各20μl ，注入液相色谱仪，记录色谱图。

7.10.2方法确认接受标准：（1）人工牛黄甲硝唑胶囊成品溶液主峰保留时间与胆红素对照品溶液主峰保留时间一致（相对偏差不超过0.5%）；

（2）人工牛黄阴性样品溶液、样品提取溶剂在胆红素峰保留时间处均应为平直基线，无吸收峰。 7.10.3方法确认记录与确认结果

（1）电子天平 型号 编号 ，高效液相色谱仪型号 编号 （2）胆红素对照品称样量：9.90mg （3）人工牛黄甲硝唑胶囊内容物称样量： 批号 20151201 ，称样量 （4）项目确认结果

胆红素含量测定---方法专属性确认结果

检查人/日期： 复核人/日期

7.11胆红素含量测定方法线性关系与线性范围确认

7.11.1胆红素含量测定方法的线性关系与线性范围确认方法：

参照人工牛黄甲硝唑胶囊质量标准WS-10001-(HD-0204)-2002【含量测定 胆红素】项下规定，分别制备以下溶液，进行线性关系与线性范围的确认：

（1）胆红素对照品贮备液：取胆红素对照品10mg ，精密称定，置100ml 量瓶中，加氯仿溶解，定容至刻度，摇匀即得。

（2）线性关系测试溶液：分别精密量取胆红素对照品贮备液1.0ml 、1.5ml 、2.0ml 、3.0ml 、4.0ml 置50ml 量瓶中，加氯仿稀释至刻度，摇匀得系列浓度的测试溶液。

试验方法：取上述每种浓度的线性关系测试溶液连续进样2针，测定胆红素峰面积平均值。液相色谱仪：LC-10AT ，色谱条件：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相为甲醇-氯仿-1%磷酸溶液（81:13:6），检测波长449nm ，每次进样量为20μl 。

计算出各个测试溶液的胆红素浓度，以浓度为横坐标，胆红素峰面积平均值为纵坐标，计算线性回归方程、回归系数R 、线性范围。

7.11.2方法确认接受标准：（1）测试溶液的胆红素浓度与峰面积之间呈良好线性关系，回归系数R ：0.995≤R ≤1；

（2）胆红素浓度线性范围：应涵盖人工牛黄甲硝唑胶囊质量标准WS-10001-(HD-0204)-2002【含量测定 胆红素】项下对照品溶液胆红素浓度4μg/ml（进样量20μl ）的80%～120%，即结果的线性范围应涵盖3.2μg/ml～4.8μg/ml。 7.11.3方法确认记录与确认结果

（1）电子天平 型号 ，编号 ，高效液相色谱仪型号 编号 （2）胆红素对照品称样量9.90 mg 含量： 98.5% （3）项目确认结果

2

2

2

胆红素含量测定方法--线性关系与线性范围确认结果

检查人/日期： 复核人/日期 7.12胆红素含量测定方法准确度确认（回收率试验） 7.12.1胆红素含量测定方法的准确度确认方法：

参照人工牛黄甲硝唑胶囊质量标准WS-10001-(HD-0204)-2002【含量测定 胆红素】项下规定，进行方法准确度的确认：

（1）胆红素对照品贮备溶液：取胆红素对照品10mg ，精密称定，置100ml 棕色量瓶中，加氯仿溶解，定容至刻度，摇匀即得。

（2）胆红素对照品溶液：精密取胆红素对照品贮备溶液1.0ml 置25ml 棕色量瓶中, 加氯仿稀释至刻度，摇匀制成每1ml 中含胆红素约4μg 的溶液，即得。

（3）回收率测试溶液：取20151201批人工牛黄甲硝唑胶囊（按照7.13项下方法测得其胆红

素平均含量为0.0124%）的内容物，研细，充分混合均匀，精密称取适量（约相当于胆红素0.1mg ），置50ml 棕色量瓶中，精密加入胆红素对照品贮备溶液1.0ml ，加氯仿-甲醇-水-盐酸(90：10：0.3：0.03) 混合液约40ml ，超声提取15分钟，取出，迅速冷却至室温，加上述溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，即得回收率试验溶液。

(4)精密吸取对照品溶液、回收率试验溶液各20μl ，注入液相色谱仪，记录色谱图及胆红素峰面积，按外标法计算回收率测试溶液中胆红素的量。 7.12.2方法确认接受标准：

At×Ws （1）计算公式：回收率测试溶液中胆红素总量(mg)=————— As×50

式中：At 为回收率测试溶液的峰面积；

As 为对照品溶液的峰面积； Ws为对照品称样量（mg ）

测得胆红素总量-样品本底胆红素量

胆红素对照品回收率（%）=——----------------------------———×100% 回收率测试溶液中胆红素对照品加入量

（2）胆红素对照品回收率限度为94.0%～106.0%，回收率的相对标准偏差（RSD ）限度为3.0% 7.12.3方法确认记录与确认结果

（1）电子天平 型号 编号 ，高效液相色谱仪型号 编号 （2）胆红素对照品称样量9.90 mg 含量： 98.5% （3）项目确认结果

胆红素含量测定方法-----方法准确度确认结果

检查人/日期： 复核人/日期 7.13胆红素含量测定方法精密度确认

7.13.1胆红素含量测定方法的精密度确认方法：

参照人工牛黄甲硝唑胶囊质量标准WS-10001-(HD-0204)-2002【含量测定 胆红素】项下方法

测定含量，进行方法精密度的确认：

（1）液相色谱系统重复性：取20151201批成品的同一份含量测定溶液, 在液相色谱仪上连续6次进样测定峰面积；

（2）胆红素含量测定的重复性：取20151201批成品，由同一人分别称取6份样品，用LC-10AT 液相色谱仪进行含量测定。

（4）胆红素含量测定的中间精密度：取20151201批成品，由甲实验人员称取6份样品，进行测定（即上述胆红素含量测定的重复性）；再由乙实验人员在不同的日期称取6份样品，用另一台液相色谱仪LC-20AD 进行测定。

7.13.2方法确认接受标准：

At×Ws ×Vt

（1）计算公式：胆红素的绝对百分含量%=———----——×100% As×Vs ×Wt

式中：At 、As 分别为样品、对照品的峰面积；

Wt、Ws 为分别为样品、对照品的称样量（mg ）

Vt 、Vs 为分别为样品、对照品的稀释倍数

（2）液相色谱系统重复性：同一份样品溶液连续6次进样，峰面积相对标准偏差限度为2.0% （3）胆红素含量测定的重复性：结果的相对标准偏差限度为2.0% （4）胆红素含量测定的中间精密度：结果的相对标准偏差限度为4.0% 7.13.3方法确认记录与确认结果

（1）电子天平 型号 编号 ，高效液相色谱仪型号 编号 （2）液相色谱系统重复性：同一份含量测定溶液, 连续6次进样测定峰面积；，结果如下：

检查人/日期： 复核人/日期

（3）胆红素含量测定的重复性：成品批号20151201，平均装量237.3mg/粒；液相色谱仪：LC-10AT ，进样量20μl

胆红素含量测定的重复性：

检查人/日期： 复核人/日期

佛山市华普生药业有限公司

（4）胆红素含量测定中间精密度：批号20151201，平均装量237.3mg/粒；甲测定液相色谱仪：LC-10AT ；乙测定液相色谱仪：LC-20AD ；进样量20μl

胆红素含量测定的中间精密度

检查人/日期： 复核人/日期：

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7.14胆红素含量测定方法耐用性确认 7.14.1胆红素含量测定---溶液稳定性试验

将成品溶液、对照品溶液放置于室温，每隔一段时间注入LC-10AT 液相色谱仪测定峰面积。溶液峰面积应在12hr 内基本稳定

检查人/日期： 复核人/日期

7.14.2 胆红素含量测定--流动相组成变化试验

按照成品法定标准WS-10001-(HD-0204)-2002胆红素含量测定项下配制成品测试溶液、对照品溶液，改变流动相比例进行检测，结果表明，流动相比例的小变动，仍然满足系统适用性试验要求。 检查人/日期： 复核人/日期

8. 三批产品按本检验方法检验的结果确认

三批人工牛黄甲硝唑胶囊胶囊，采用与检验方法确认方案一致的检验方法，亦即法定药品标准WS-10001-(HD-0204)-2002规定的方法，全检结果确认如下：

检查人/日期： 复核人/日期

9. 偏差与漏项控制：

人工牛黄甲硝唑胶囊检验方法确认过程中存在和发现的任何偏差与漏项，都应进行详细的记录，并应按公司GMP 文件《偏差处理规程》进行调查与处理。

偏差调查与处理的报告和支持文件，应作为此确认方案的附录部分。

检查人/日期： 复核人/日期：

10. 验证报告会审

验证报告会审表