PCR技术快速检测鉴定啤酒中的污染菌和破坏性菌

　　现代啤酒由单菌种――酵母发酵而成。但在整个啤酒酿造过程中，酿造设备、空气、酿造用水等诸多因素都有可能导致有害微生物进入麦汁或发酵液中，如果这些有害微生物大量生长繁殖，就会污染麦汁或啤酒。污染腐败的细菌对啤酒的质量影响相当大，会造成啤酒总酸升高、高级醇含量增多、啤酒口味不协调、有杂味或异味、啤酒黏度增加、无菌滤膜堵塞。影响酵母正常生长与发酵，轻者影响啤酒口味，重者造成啤酒浑浊、沉淀、更严重的情况下会影响啤酒的质量安全，给消费者和啤酒厂家造成伤害和损失。目前对啤酒酿造和饮用安全构成威胁的微生物主要可分为3类：革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和野生酵母。 　　目前国内啤酒厂普遍采用传统的培养基检测方法，该方法是在厌氧环境下通过专项培养基(常用MRS、NBB培养基)培养，检测对啤酒有严重危害的厌氧菌和微好氧菌，需要5～7天甚至更长的培养时间才能完成检测和鉴定，其结果往往滞后于生产，无法及时指导技术人员对酿造过程中产生的污染菌进行监控，尤其是原生啤酒和纯生啤酒的生产中，对卫生要求更为严格。为提高微生物污染的检测速度，建立一套经济、实用。有效的微生物污染快速检测、鉴定。监控、预防体系成了现代啤酒工业非常迫切的课题之一。 　　PCR技术在微生物检测方面有其独特的优点，可以同时定性检测和鉴定破坏性菌，也能从根本上解决有害菌检测问题。多年来，德国拜发R－Biopharm公司与德国知名啤酒企业合作，致力于将PCR技术应用于啤酒有害菌鉴定的研究中，开发了系列啤酒Real－time PCR有害菌检测试剂盒，可以在2小时到3天时间内快速检测和鉴定出啤酒中的污染菌和破坏性菌，解决了传统方法检测周期长、结果滞后于生产等问题，得到国外多家大型啤酒企业的认可。该方法在欧洲已被数家知名啤酒厂家普遍应用于生产线上的实时采样检测、生啤快速质控和品牌风味控制上，得到了很好的反馈。 　　对于品牌啤酒而言，生产质量控制固然重要，但日益扩大的生产规模和跨地域兼并带来的多地生产，也常常导致在不同的生产地和生产线上生产出的品牌啤酒风味不一致，为品牌啤酒的品牌维护和推广带来了很大的困扰。对此，以啤酒酿造为传统的德国等欧洲国家率先引进了德国拜发R－Biopharm公司的GEN－IAL啤酒多元筛查和鉴定检测PCR方法，对生产线各监控点的微生物情况进行实时检测和控制。 　　德国拜发R-Biopharm公司的GENIAL啤酒Real-time多元筛查检测试剂盒及GEN-IAL啤酒破坏性菌特异性检测试剂盒可在几小时之内完成对主要微生物快速、可靠的检测；可以检测出啤酒中所有相关的有害菌(如Lactobacillus乳酸菌、Pediococcus小球菌或Megasphaera巨型球菌)及酵母(包括Saccharomyces diastaticus糖化酵母)；适用于生产过程中的工艺质量控制及成品在线控制，可以将生产损耗降到最低，避免不合格产品召回，从而保护公司品牌形象。 　　德国R-Biopharm公司的PCR产品适用于啤酒及其他饮料产品中，并符合最新标准中关于有害酵母菌及细菌的检测要求，操作简单、快速。 　　 　　1、DNA提取 　　 　　GEN－IAL啤酒DNA提取试剂盒分为啤酒磁性DNA检测试剂盒和Simplex Easy DNA快速提取试剂盒，前者是通过磁性分离法分离出超纯DNA，特别适用于含抑菌成分的样品：后者则是在一个试管中实现快速简单的DNA热提取，无污染，十分适合预增菌的啤酒样品。 　　 　　2、筛选 　　 　　一个PCR反应即可区分出细菌和酵母菌。GEN－lAL real-time PCR啤酒筛查试剂盒可检测和区分啤酒中的细菌及酵母菌，一次反应即能检出5类菌种，能够通过杂交探针(FRET，TaqManTM)检测出乳酸杆菌、片球菌、巨球型菌属、Pektinatus及酵母菌。预富集只要3个小时，所有的有害菌即可直观显现出来。如果样品包含其他微生物，也不需要进行再次确认。该系列GEN-lAL啤酒筛查试剂盒具有高灵敏度和高特异性的特点，无假阴性，每个PCR反应混合过程中均进行内部质控，UDG体系可避免假阳性结果。可配合市场上各种real-timePCR仪使用，实现自动化操作。 　　 　　3、菌种确认 　　 　　GEN－lAL啤酒菌种确认试剂盒可对啤酒污染物进行种特异性检测。适用于单重、双重及多重PCR反应，灵敏度高，特异性强。可提供基于FRET TaqMan或Sybr Green技术基础的各种细菌及酵母菌的GEN-lAL啤酒菌种确认试剂盒。GEN-IAL啤酒菌种确认试剂盒主要包括醋酸菌(Aceticacid bacteria)DNA检测、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)DNA检测、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)／类布氏乳杆菌(Lactobacillus parabuchneri)DNA检测、干酪乳酸杆菌(Lactobacilluscasel)／类布氏乳杆菌(Lactobacillusparabuchneri)／鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus)／玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)DNA检测、丘状乳杆菌(Lactobacillus collinoides)／短乳杆菌(Lactobacillus brevis)／林德奈氏乳酸杆菌(L8CtObacillusIindneri)DNA检测、丘状乳杆菌(LactobaciIlus collinoides)／类丘状乳杆菌(Lactobacillus paracollinoides)DNA检测、棒状乳杆菌(Lactobacilluscoryniformis)DNA检测、林德奈氏乳酸杆菌(Lactobacillus lindneri)DNA检测、Lactobacillus perolens DNA检测、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)／类植物乳杆菌(Lactobacillus parapl)／戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)DNA检测、乳杆菌(Lactobacillusrossiae)DNA检测、酿酒巨球形菌(Megasphaera cerevisiae)DNA检测、嗜啤酒梳状菌(Pectinatuscerevisiiphilus)DNA检测、培克提那塔司弗利辛吉丝菌(Pectinatusfrisingensis)DNA检测、梳状菌属(Pectlnatus spp)DNA检测、有害片球菌(Pediococcus damnosus)DNA检测、梳状菌属(Pectlnatus spp.)／巨球形菌属(Megasphaera spp.)DNA检测、异常德克拉酵母(Dekkera anomala)DNA检测、布鲁塞尔德克酵母(Dekkerabruxellensis)DNA检测、异常毕赤酵母(Pichia anomala)DNA检测、糖化酵母(Saccharomyces dlastaDcus)DNA检测、膜醭毕赤氏酵母(Pichiamembranaefaciens)DNA检测、底层发酵酵母(Bottom fermented yeast)DNA检测。上层发酵酵母(Top fermentedyeast)DNA检测、脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus spp)DNA检测。除此之外，还可以针对啤酒企业要求专门研发其所需检测的菌种检测试剂盒。 　　在国外，特别是欧洲和日本，PCR技术应用在啤酒中有害菌的快速检测和鉴定方面已经比较成熟，而在国内则应用很少。在德国拜发R-Biopharm公司的推广下，国内现有多家知名啤酒企业与德国拜发R-Biapharm公司共同建立啤酒有害菌的快速检测方法。为更有效地推广该检测方法，德国拜发R-Biopharm公司还推出了Spartan DX-12便携式DNA分析仪，该仪器可配合德国拜发R-Biopharm公司的有害菌检测试剂盒使用，便于啤酒工厂检测人员操作，且其价格仅为大型PCR仪的十分之一。Spartan DX-12便携式DNA分析仪体积小，使用简单方便，配备专用分析软件，与大型real-time PCR相比可大大降低企业检测成本、人员培训成本和实验室场地成本。 　　为了更好地保证啤酒质量，现代啤酒工业非常需要一种快速微生物检测技术，以解决传统微生物检测结果大大滞后于工艺生产的尴尬状况。PCR技术应用于啤酒有害菌的鉴定，不仅快速、准确，而且可以预测有害菌对啤酒的腐败能力，及时为生产提供指导性信息，具有巨大的推广价值。德国拜发R-Biopharm公司愿与国内啤酒企业一同努力，推动啤酒有害菌快速检测技术的发展。