生物固氮基本介绍与联合固氮

生物固氮的基本介绍与联合固氮

生物固氮是自然生态系统中氮的主要来源。全球生物固氮的量是巨大的，海洋生态系统每年生物固氮量在4×1013～2×1014 g ，陆地生态系统生物固氮量在9×10B ～1．3×10149，而工业固氮量在20世纪90年代中期每年约为1．4×10M g 。可见，生物固氮在农、林业生产和氮素生态系统平衡中的作用很大。生物固氮(nitrogen fixation)在20世纪60年代以前的主要工作是在广泛开展分离、鉴定、分类和固氮的生理以及固氮生物在农业上的应用。20世纪70年代后，固氮微生物学的侧重点转入固氮酶系统和固氮基因转移方面的研究。目前国内的研究集中以根瘤为研究对象，展开了一系列研究。

1．生物固氮的意义

氮是构成蛋白质和核酸的主要物质，是一切生命的要素，没有就没有生命。在大气中氮气的含量约为79％，但这种分子氮并不能直接为高等植物吸收利用，只有豆科植物和少数非豆科植物通过与根的共生固氮作用，才能把大气中的分子态氮转变为固态氮。这些氮除满足根瘤菌本身的需要外，还可为宿主提供生长发育可以利用的含氮化物。同时，根瘤菌及其所固定的氮化合物，可以提高土壤的含氮量，在间作和轮作上具有重要的意义。然而，水稻、小麦、玉米、高粱等农物无固氮功能，即使豆科植物在幼苗时期也没有固氮能力，故要使它增产就必须施用复合肥。氮肥的合成，需要消耗大量的能源。而且氮肥使用率只有50％一75％，未利用部分的流失会造成污染。故大量使用氮肥，不仅会增加农业成本，而且会造成土壤、水体及农产品的污染。环境质量意识日益增强的今天，开展生物固氮及其在农业中应用的究，以减少化合成氮肥的使用，具有特别重要的意义。

2. 生物固氮作用机

固氮酶由钼铁蛋白和铁蛋白。钼铁蛋白又称为钼铁氧还蛋白或分子氮酶，是真正意义上的“固氮酶”；铁蛋白又称固氮铁氧还蛋白或固分子氮还原酶，其实质是一种“固氮酶的还原酶”。固氮酶钼铁蛋白有三种状态，即氧化态、半还原态和完全还原态。当半还原态的钼铁蛋白和还原态的铁蛋白组合在—起时，成为稳定固的复合体系。这是还原铁蛋白的电子传递到半还原态钼铁蛋白上，使它成为完全还原态；而铁蛋白本身被氧化，随后再由细胞中电子传递链所提供的电子还原。完全还原态的钼铁蛋白络合分子氮，同时ATP 水解成ADP+Pi，释放出大量能量，使电子和氢离子同氮结合，生成两分子。现在一般认为，在这个反应过程中固氮酶钼铁辅因子起关键作用，它是固氮酶的活性中心。研究表明，不同种类的固氮微生物都有共同的固氮基因控制着固性遗传，nif 基因和固氮酶只存在于固氮菌体中。在根瘤菌中除了固氮基因之外，还存在着结瘤基因、使宿主的根毛变形弯曲的基因、根起始基因和产生色素的基因等。已经证实，根瘤菌中的基因和结瘤基等都定位在质粒E 。

3．生物固氮及其分类

空气主要由氧气和氮气组成。其中氮气约占4／5．在自然界的千万种生物中，有一些生物能够直接吸收空气中的氮素作为养料，它们将分子态氮先还原成氮，再转化为氨基酸和蛋白质，这就叫生物固氮．豆科植物等，其根部长有许多小球。它是由根瘤菌共生形成的根瘤，就具有固氮作用；又如稻田中的水生蕨类植物满江红(俗称红萍) ，由于叶腔中有固氮鱼腥藻共生而能吸收和利用大气中的氮；以上两种形式称为共生生物固氮．生物固氮的形式除共生生物固氮外。还有细菌自生固氮和联合固氮．联合固氮(又称为半共生固氮) 它又分为内生联合固氮和外部联合固氮．目前已发现有固氮能力的微生物有60多属约数百种，包括细菌、放线菌、蓝绿藻等．

4．植物如何利用氮元素

高等植物不能吸收大气中分子态氮(N：) ，仅能吸收化合态氮。植物可以吸收氨基酸、天冬酰胺和尿素等小分子有机物，但是植物的氮源主要是无机氮化物，而无机氮化物中以铵盐(NH4+)和硝酸盐(NO3-)为主。氨化作用土壤中的含氮有机物主要是蛋白质类，另外还有核酸、

尿素、尿酸、几丁质等。这些含氮有机物的含氮部分在微生物的作用下最终的降解产物是氮，这叫做氨化作用。

4． 1尿素和尿酸的氨化作用

尿素和尿酸是人畜的主要排泄成分，尿酸水解时产生尿素。植物虽然可以直接吸收尿素，但进入到土壤中的尿素一般都很快被尿素细菌和土壤中的尿酶分解为碳酸铵。不过所生成的碳酸铵很不稳定，会很快分解为氨和二氧化碳。

4． 2蛋白质和核酸的氨化作用

氨基酸能通过氧化作用、水解作用和还原作用脱下氨基，释放出氨。例如：

氧化脱氨基作用：

R —CHNH2COOH+02→R —COOH+C02+NH3。

水解脱氨基作用：

R —CHNH2COOH+H→R —COCOOH+NH3。

还原脱氨基作用：

R —CHNH2COOH+2H→R —CH2COOH+NH3。

含氮碱基杂环断开后，进行着与氨基酸类似的脱氨基作用。

4．3硝化作用

由氨化作用产生的氮少部分溶于水后电离出铵根离子(NH4+)并被植物吸收，绝大部分氮在硝化细菌的作用下进一步氧化为硝酸，产生硝酸根离子，从而被植物吸收。反应式如下： 2NH3+302-→2HN02+2H20；2HN02+02→'2HN03。

5植物体内氮素转化

5．1硝酸盐的代谢还原

植物从土壤中吸收铵盐后，即可直接利用它去合成氨基酸。如果吸收的是硝酸盐，则必须经过还原才能利用，因为蛋白质的氮呈高度还原状态，而硝酸盐的氮却呈高度氧化态。一般认为，硝酸盐经过以下步骤最后还原成氮：硝酸→亚硝酸→次亚硝酸→羟氮→氮。

5．2氮的同化作用

植物吸收的铵盐在植物体内转变成氮，吸收的硝酸盐最终也还原成氮，这些氮立即被同化。游离氮的量稍微多一点即毒害植物。还原氮基化：氮与呼吸代谢的中间产物仪一酮酸结合，形成氨基酸，例如d 一酮戊二酸与氮结合，在谷氮酸脱氢酶的作用下，还原为谷氮酸。氮基转换作用：氮基转换作用是一种氨基酸的氮基被转移到一种酮酸的酮基上，接受体转化为一种新的氨基酸。氮基转换作用增加了植物体内氨基酸的种类。氮与二氧化碳结合，形成氮甲酰磷酸。氮也可以与氨基酸结合，形成酰胺。例如，在谷氨酰胺合成酶的作用下，氮与谷氮酸形成谷氮酰胺。同样，天冬氮酸与氮形成天冬酰胺。谷氮酰胺和天冬酰胺在高等植物体内是氮的临时保存形式，可解除游离氮的毒害；当植物体内氮不足，酰胺又能分解出氮供植物利用。

5．3蛋白质和核酸等含氮有机物的合成

氮的同化作用形成各种氨基酸，通过转录和翻译形成蛋白质。氮甲酰磷酸是合成核苷酸的基础，核苷酸经生化反应生成核酸。

6．联合固氮体系

长期以来，人们的主要研究工作集中在以下几方面：①提高现有固氮生物的固氮能力；②提供优质高效的微生物肥料，为农业开发肥源；③人工模拟固氮酶在常温常压下还原分子氮，使氮肥的]j业生产有一个历史性突破。其中联合固氮的研究在其中起着重要的作用。在联合固氮体系中，固氮细菌广泛生活在植物根际和根表，当进行固氮时，植物根系的分泌物可以提供必需的能量和碳素，它们之间的关系是互利互惠的。联合固氮体系从植物方面来讲，主要有玉米、小麦、高粱、水稻、甘蔗、棉花、大麦、甜马铃薯等农作物和热带亚热带牧草如

雀稗、马唐和大米草等，对乔木树种根际联合固氮菌的研究有芒果和马尾松”。联合固氮作用在自然界广泛存在。近年，对联合固氮菌的筛选与鉴定取得了一些进展，对联合固氮体系的深入研究和探讨具有重要的意义。杨海莲等(1999)采用乙炔还原法”N 同位素测定从水稻上获得了29株具有体外固氮能力的水稻共生联合固氮细菌卜。丁延芹等分离了23株在玉米根际占优势的细菌，对玉米根际促生细菌的固氮作用、拮抗作用、产生铁载体和植物激素等重要生物学作用进行了研究，获得一批具有研究和应用前景的植物促生细菌。有研究报道称，从盐沼植物根系中分离出来的副溶血性弧菌具有高效的固氮能力，并应用互花米草与该菌之间的相互作用，为该菌的固氮作用提供了依据。另有研究报道菊花、月季和香石竹联合固氮细菌的分离筛选方法，发现菊花、月季、香石竹根际都不同程度地存在着联合固氮细菌，为开创非豆科花卉联合固氮领域作了初步研究。

7．联合固氮的机理

7. 1联合固氮系统的形成

联合固氮体系与其他固氮体系不同，没有形成特异分化组织。Dtibereiner 提出把联合固氮菌在根表上定殖作为联合固氮体系形成的标志之一。形成联合固氮体系大致经历趋化、结合和侵入3个阶段。

趋化是联合固氮菌所具有的一种通过细菌鞭毛的旋转运动对根分泌的有机酸、糖、氨基酸形成的梯度和低氧浓度表现出化学激活现象且这些细菌向植物根际靠近的能力。联合固氮菌可以利用这种能力选择宿主根际环境，使联合固氮体系双方有一定的专一性。结合是联合固氮体系形成过程中的关键一步。联合固氮细菌结合到根表面可分成两个阶段：第一阶段称为吸附，该阶段快速(不超过2h) ，不稳定，由细菌蛋白质来决定；第二阶段称为固定，需时间长 (8h后开始116h 后达最大值) ，稳定不可逆，决定于细菌表面胞外多糖，这一阶段标志是宿主根产生民纤维和大量粘液。在植物根表面存在许多能够诱导固氮菌在植物根系定殖的有机物，包括植物粘质、根表糖基、植物凝集素；在细菌表面也l 有很多适合与植物根系结合的物质和组织，包括细胞外多糖、鞭毛、细胞表面蛋白性多束纤维素HJ 。这些物质和组织之间相互识别后，细菌和植物根系就完成结合。联合固氮菌能够通过伤口、根毛和表皮层部位进入植物组织内，定殖于表皮和皮层细胞的间隙，有的甚至进入中柱组织细胞，定殖于维管柬细胞。这种入侵后形成的联合固氮体系非常有利于提高固氮效率。在植株内部的固氮菌更容易取得群落优势；所受到外界环境的影响较小；固氮的产物更易被植物吸收利用等。

7．2信号传导机理

趋化蛋白Mcps 对细菌趋化产生重要作用。该物质是一种特殊的化学受体和信号转导物，当它们与化学效应剂起反应时，分子的甲基化水平发生了变化。迄今为止已证明几乎所有被研究的细菌中都含有Mcps 。但是，通过分析甲硫铵酸营养缺陷型菌株体内甲基化反应及利用E ．coil 抗转导蛋白抗体进行的实验都证明，在巴西固氮螺菌存在一种不依赖Mcps 甲基化作用的趋化性途径。一般认为植物根系分泌物、氧低压等能够诱导联合固氮菌的趋化，但是联合固氮菌的趋化性可能并不都由营养诱导，在转录和翻译水平上存在一定的调控机制。

7．3群体感应

群体感应(Quomm sensing) 是细菌根据细胞密度变化调控基因表达的一种生理行为，具有群体感应的细菌能产生并释放自体诱导物(Autoinducer，AI) 的信号分子，它随着细胞密度的增加而增加，当积累到一定阀值时可以与调控蛋白结合从而启动细菌中特定基因的表达。细菌细胞通过群体感应与周围环境进行信息交流，从而改变其生理活性，如共生、细菌毒性、竞争、结合、抗生素的产生、运动性、孢子及生物膜的形成等。高丝氮酸内酯类(N—acvl —homoserine lactones ，AHIJB) 信号分子调节细菌基因的表达被认为是细菌胞间通讯最具代表性的例子。群体感应被用来调控许多重要性状，但在纯培养条件下是不易发现哪些性状是由群体效应来调控的。并且在土壤自然条件下， Ahls 在环境中能够不断被化学反应和生物的

方法所分解，高PH 、酶的降解作用还会降低信号分子的浓度、影响调控蛋白的活性，所以在纯土壤中很少发生群体感应，但是在特定的植物根系区域和酸碱条件下，Ahls 会发生积累，达到阀值从而引发群体感应。

8 .联合固氮的研究现状

8 .1联合固氮作用的测定方法

合固氮作用的测定有多种方法。凯氏和杜马氏定氮法既可以用于实验室，又可以用于田问，但是方法费时、灵敏度低、难以准确定量。N 同位素示踪法是确认菌株有无固氮能力最直接可靠的方法，最常用的是N 示踪法，但缺点是N 价格昂贵。乙炔还原反应的温育时间不同，直接影响乙炔还原法测定固氮酶活性结果的可比性。有研究提出，应用3．5％甲醛水溶液作为联合固氮酶活性阻断剂，可使联合固氮体系中的乙炔还原反应维持在特定时间后予以阻断，确保大批量的联合固氮酶活性测定条件的一致性。

8 .2联合固氮分子生态学研究方法

免疫捕获或免疫磁性分离技术，DGGE 技术，RFLP 技术等随着分子生物学的进展联合固氮工程菌的研究显的越来越重要，固氮遗传工程受到了广泛重视，为最终通过转基因手段实现非豆科植物自主固氮提供了可能的突破点。在研究固氮基因表达和调控的基础上，有针对地进行固氮菌的遗传改造，构建高效的固氮菌株，以提高固氮效率，减少化肥施用，为作物提供更多的固氮量。

由于联合固氮菌与根系只是松散的联合，没有形成稳定的共生结构，联合固氮的效率受植物生长状况、土壤、肥力、气候、土著菌竞争及铵和氧浓度等因素的影响很大，因此接种联合固氮菌剂后都有促进植物生长的趋势，并伴随有一定的增产效应，但这种增产效果不稳定。目前在生产上用联合固氮菌剂完全替代氮素肥料是不切实际的，但可作为一种辅助的农业措施。联合固氮研究是一门新兴的研究领域，在前人的努力下，在各方面取得了许多重要的进展，为今后联合固氮的研究提供了丰富的经验和打造了良好的基础。联合固氮机理研究是重点研究内容。目前完整的联合固氮系统信号传导过程还不清楚，整个调控机制也没有深入研究。Mcps 的甲基化反应、Quorum sensing等的研究为信号传导做了初步解释，而胞外多糖、植物凝集素、植物分泌物等在固氮中的具体作用需要更深入的研究。

展望

生物固氮的研究具有重要的意义，生物固氮酶和固氮基因研究，固氮物种在生态系统中的作用生物固氦应用研究，固氮酶高分辨率的空间结构研究均取得了一定成果。但是生物固氮是个非常复杂的问题，它在农业上能增强土壤肥力，为提高作物产量和质量发挥重要作用；同时，在净化环境、维持生态平衡方面也起着重要作用；而且固氮微生物不仅与高等植物建立共生固氮体系，还可以与某些昆虫及更高级动物建立自主固氮模式。这些都为未来研究带来了动力，指明了方向。而其中联合固氮可以为植物提高生态性的氮肥，具有很好的生态效益。利用联合固氮技术可以促进植物生长、提高植物抗性、改善经济树种的产品品质、节约能源等。而且可以解决由于土地单一施肥所引起的地力衰退、农业环境面源污染加剧等环境问题。因此，应用联合固氮技术是一项具有生态、社会、经济三重效应的农业工程。