YYH_实验四 细菌的革兰氏染色
实验四 细菌的革兰氏染色
一、实验目的
1. 掌握革兰氏染色法的原理及操作步骤；
2. 区别几种细菌的革兰氏染色反应；
3. 进一步熟悉油镜的使用方法。
二、实验原理
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G +）和革兰氏阴性菌（G -）两大类。革兰氏染色法是复染色法（即采用两种或两种以上的染料进行染色）的一种。
革兰氏染色法的基本步骤是：先用结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮) 脱色，最后用复红或番红复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色) ，该菌属于革兰氏阴性菌。
革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇(或丙酮) 脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮) 溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。
三、实验材料
显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、吸水纸、70%酒精、酒精棉球、载玻片、废液桶、洗瓶、纱布、火柴、镊子、水、结晶紫染色液、革兰氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红、液体石蜡
菌种：枯草杆菌、葡萄球菌、产气杆菌
四、实验步骤
1. 涂片
取一洁净的载玻片，用记号笔在载玻片的左右两侧标上菌号，并在两端各滴一小滴蒸馏水，以无菌操作方法用接种环分别挑取少量菌体涂片，玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。
2. 自然干燥
3. 火焰固定
4. 初染
滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜) 于涂面上，染色1min ，倾去染色液，用自来水冲洗至洗出液为无色为止，将载玻片上水用吸水纸吸干。
5. 媒染
用革兰氏碘液媒染约lmin ，水洗。目的：使革兰氏碘液与结晶紫发生化学反应，形成大分子复合物。
6. 脱色
用滤纸吸去玻片上的残水，用滴管流加95%的乙醇脱色，时间20～30s ，一般不要超过40s 。脱色时间一到立即水洗，终止脱色，将载玻片上水甩净。
乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。
7. 复染
在涂片上滴加石炭酸复红复染约2～3min ，水洗，然后用吸水纸吸干。在染色的过程中，不可使染液干涸。
8. 镜检
干燥后，用油镜观察。判断两种菌体染色反应性。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌（G+），被染成红色的为革兰氏阴性菌（G-）。
五、实验结果
根据观察结果，绘出两种细菌的形态图。并在下方标明该细菌的革兰氏染色反应和颜色。