大鼠及人肝枯否细胞的分离纯化和培养_张长习
308肝胆外科杂志2007年8月第15卷第4期 Journal of Hepatobiliary Surgery, V ol, 15, N o . 4, A ug . 2007
大鼠及人肝枯否细胞的分离纯化和培养
张长习, 高绪照, 谢文彪
【摘要】 目的 改进大鼠肝枯否细胞分离、纯化和培养技术, 探讨从人体肝脏手术标本中分离、纯化和培养枯否细胞的可行有效方法。方法 32只S D 大鼠肝脏及9例人体肝脏手术标本用于本实验。大鼠肝脏经门静脉、人体肝组织通过肝静脉灌注预灌流液, 灌注后肝脏标本采用离体胶原酶灌注消化获得细胞悬液, 差速离心获得富含KC 的肝非实质细胞。改传统
P BS 重悬肝非实质细胞为25%percoll 重悬, 形成新percoll 梯度由上向下为:P BS 、含肝非实质细胞的25%percoll 、50%percoll,
不连续密度梯度离心分离获得枯否细胞, 最后选择性贴壁进一步纯化。应用吞噬功能实验对KC 进行鉴定, 台盼蓝拒染实验
66判定细胞活力。结果 最终获得的枯否细胞的产量分别为:大鼠311±015×10/g肝脏, 人体肝脏组织为213±014×10/g肝
脏, 细胞活力和纯度均达90%。结论 本实验建立的大鼠及人体肝脏枯否细胞分离方法, 简便经济, 效果稳定, 获得的枯否细胞可用于进一步的实验研究。
【关键词】 大鼠; 人体; 枯否细胞; 细胞培养
【中图分类号】 R 575 【文献标识码】 A 【文章编号】10062(I S OLAT I O N PUR I F I CAT I O N AND CUL TURE O F RAT AN D HU M AN ZHAN G Chang 2xi, CAO Xu 2zhao, X IE W en 2biao . The 2nd to N Heng Yang C ity, Hy N an Provinec 421001, China )
【Abstract 】 O bjecti ve To and si m p le technique f or is olati on and purificati on of rat kupffer cells, then t o ex 2
p l ore an efficient and way purify hu man kupffer cells fr om the liverbi op sies s peci m en of patients undergoing hepatic surgery . M ethods got fr thirty 2t w o S D rats and nine cases of hu man liver bi op sies s peci m en were used in this experi 2ment . The rat liver was separated and perfused thr ough hepatic portal vein with collagenase t o obtain liver cell sus pensi on, while hu man liver wedge bi osies were perfused via hepatic vein and cut int o s mall tissue frag ments t o be further digested with collagenase at 37℃f or 30m inutes t o get liver cell sus pensi on . The filtrated cell sus pensi on was centrifuged at 50g t o re move hepat ocytes, Then the non 2paten 2chy mal cells was collected and resus pended in 25%(v/v) percoll s oluti on . Lastly kupffer cells were sepatated fr om other non 2parenchy 2mal cells by inconsequential density gradient centrifugati on with percoll, and the kupffer cells were further enriched by selective attach 2ment according t o attaching ti m e and culture conditi ons . Kupffer cells were identificated by endocyt osis, and the viability was deter m ined by Typan blue exclusi on staining . Results W ith this technique, the yield of rat liver kupffer cells is about311±015×10per gra m liv 2er;W hile in hu man liver 213±014×10cells were harvested per gra m liver, the viability and purity of kupffer cells was >90%.Con 2clusi on The technique, with which the kupffer cell is olated and cultured fr om rat and hu man livers, is si m p le, convenient, efficient and reliable, and the hu man kupffer cells can be further used t o study the bi ol ogical functi ons .
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【Key words 】 rat; hu man; kupffer cell; cell culture 枯否细胞(KC ) 是定居肝脏的巨噬细胞, 约占巨噬细胞总数80%～90%, 在肝脏中专司清除内毒素、细菌、病毒和肿瘤细胞的功能, 同时可分泌多种活性因子影响肝细胞结构
2+和功能, 在肝细素、Fe 、脂蛋白和胆醇代谢中也发挥重要作
KC 则对人体肝脏疾病发生发展机制进行细胞和分子生物学
研究具有重要意义。因供体普遍缺乏, 从整肝分离人KC 显然不现实, 故建立从手术切除肝组织中分离纯化KC 的方法, 则有较大实用价值。
1 材料与方法1. 1 主要材料
用[1], 但KC 分离纯化困难。国内外[2～6]不少文献描述了
KC 的分离方法, 但多就大鼠枯否细胞分离方法进行报道, 并
且在分离过程中存在一定不足。由于种系差异, 若能获得人
【基金项目】湖南省教育厅资助项目(01C182)
【作者单位】1. 南华大学附属第二临床医院, 衡阳 421001
2. 湖南张家界人民医院
清洁级S D 大鼠32只, 重为250～300g, 购于南华大学实验动物中心; 手术切除肝组织, 南华大学附属第二医院外科良性肝脏疾病肝切除标本9例。切除后沿切下肝组织基底部血管, 向外楔状切下健康肝组织, 从肝脏断面血管注入
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含肝素钠1×10U /L的4℃D 2Hanks 液, 直至肝组织残留血
【作者简介】张长习, 男。研究方向:普通外科。【收稿日期】2006-06-22
液冲出变白, 置冰D 2Hanks 液移入实验室; collagienase type Ⅱ为I nvitr ogen 产品; percoll 分离液为Sig ma 产品; 培养基为
GI B CO 产品; 胎件血清为杭州四季青生物工程公司产品;
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HEPES 为Am resco 公司产品; 其他试剂均匀为分析纯产品。1. 2 分离培养用液体
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胎牛血清的RP M I 21640培养液, 调整细胞溶度为1×10/ml,
接种于玻璃培养瓶及6孔板, 培养60m in 后, 轻轻洗去未贴壁细胞, 获得贴壁枯否细胞, 加入含10%胎牛血清的RP M I 2
1640培养液。置37℃、5%CO 2培养箱内培养, 每24小时更
前灌流液:含NaCl 810g/L, KCl 1014g/L,KH 2P O 40106
g/L,Na 2HP O 4・12H 2O 0115g/L,NaHC O 30135g/L,E DT A 012g/L,HEPES 418g/L,酶灌流液:含NaC 1810g/L,KCl 1014g/L,KH 2P O 40106g/L,CaCl 2・H 2O 1105g/L,Na 2HP O 4
换培养基[7]。
1. 7 枯否细胞鉴定活力判定
・12H 2O 0115g/L,NaHC O 30135g/L, HEPES 214g/L,酚红
0101g/L,1%collagenase type Ⅱ。percoll 液:取5m l 无菌815%NaclI 溶液与45m l percoll 原液配成普通percoll 液。
通过形态学观察及吞噬功能实验进行鉴定:在体外培养的6孔板细胞换液时, 加入含微量已消毒碳素墨水的培养基, 8h 后倒置显微镜观察, 记数200个细胞, 观察具有吞噬功能的细胞数量。同时通过对比体内肝脏吞噬细胞对大鼠枯否细胞进一步鉴定:在获取大鼠肝脏前24h, 经鼠尾静脉注射015m l 含10%碳素墨水的D 2Hanks 液, 按前述方法分离枯否细胞, 培养贴壁清洗后, 对比观察细胞形态和贴壁情况[6]。收获培养48h 细胞进行Gie m sa 染色观察细胞形态。台盼蓝拒染实判断细胞活力。
2 结果
2. 1再取30m l 普通percoll 液与30m l 0185%的NaCl 溶液混合配成50%的percoll 梯度液; 取20m l 普通percoll 液与60m l
10185%的NaCl 溶液混合配成25%percoll 梯度液, 4℃保存
备用。
1. 3 肝组织灌注消化制备肝细胞悬液
大鼠麻醉后, 在上腹部作“+”型切口, 充分暴露门静脉主干, 在其前壁做“V ”形切口, 插入预先充满前灌注液的导管并固定, 以前灌流液经门静脉灌注, 流量约为3m l/min, 灌注过程中剪开肝下下腔静脉并轻按摩肝脏促使血液流出, 直至肝脏呈黄白色。将肝完整分离, 周血管结扎。抽取适量1%胶原酶溶液() , 经门静脉灌注肝脏充分膨胀, 3注, , 。若肝组织消化不良则再加入适量1%, 37℃孵育30m in, 依次经
100目、200目不诱钢滤网过滤, 收集细胞悬液。
, 进一步贴壁纯化后, 获得枯否细胞
6:大鼠311±015×10/g肝脏, 人体肝脏组织6213±014×10/g肝脏, 细胞活动和纯度均达90%。
2. 2 光镜下形态学观察
新分离枯否细胞在倒置显微镜下呈球形, 折光性较强, 悬浮于培养基中:部分细胞30m in 即可贴壁; 培养2h 即可见部分细胞伸出伪足, 24h 细胞即完全伸展, 呈多角形, 十字形等不规则形态, 有些可见较长伪足, 细胞核呈肾形。2天后细胞质中可见形态大小不一的吞噬颗粒, 随时间延长, 吞噬颗粒逐渐增多, 至培养第10天时, 细胞变圆, 内含有大量吞噬颗粒, 贴壁能力差。
2. 3 吞噬功能实验
手术切除肝组织9例。从肝脏断面基底部血管(肝静脉) 插管, 在灌注前灌液流液过程中, 将其它有显著漏液的血管在灌注完成后结扎, 待肝脏完全变为淡黄色时, 灌注胶原酶, 待肝组织轮廓塌陷, 去除结缔组织。余处理同上述。
1. 4 差速离心获取肝非实质细胞
对所获得肝细胞悬液, 采用50g 、3m in 离心, 弃沉淀。所得上清液(富含肝非实质细胞) 用500g 5m in 离心, 弃上清。所得沉淀用不含血清的RP M I 21640重悬。如上交替离心3次, 最后即可获得富含肝非实质细胞的沉淀
1. 5 percoll 梯度离心纯化
[7]
光镜下观察可见枯否细胞浆内吞噬的墨水颗粒, 并且在大鼠中, 通过鼠尾静脉注射碳素墨水示踪证实, 用本法提取的细胞, 体外吞噬功能实验发现与体内吞噬功能相似, 故贴壁细胞即为肝脏来源的具有吞噬功能的KC 。Gie m sa 染色也进一步证实分离得到的贴壁细胞即为KC 。
3 讨论
。
将沉淀用25%percoll 重悬, 充分吹打均匀。取离心管数支, 沿管壁缓缓加入3m l 50%percoll 、3m l 重悬肝非实质细胞的25%percoll 和2m l D 2Hanks 液, 加样完成后两层之间分界清楚(为方便观察, 25%percoll 用含酚组的0185%
NaCl 溶液配制) , 4℃900g 离心20m in, 整个离心管液体分
肝脏枯否细胞是机体单核一巨噬细胞系统的最大组成部分, 在机体免疫、内环境稳定的维持、肝细胞的结构和功能调控及物质代谢等过程中发挥重要作用。但KC 仅占肝非实质细胞数的20%～40%, 肝脏体积的211%, 分离较为困难。国内外[2～6]不少文献描述了KC 的分离方法, 常用的有酶消化法, 结合差速离心、等密度梯差离心、选择性细胞毒作用及离心淘洗等方法进行纯化, 但多就大鼠枯否细胞的分离方法进行报道, 并且在分离过程中存在一定不足; 如原位两步灌流法实验时间长, 胶原酶消耗量大成本高; 链霉蛋白E
(p r onase E ) 消化破坏肝细胞的方法, 能改变KC 膜蛋白表达
成四带:最上层物质不能渗入percoll, 主要有细胞碎片、损伤细胞少量非实质细胞; 中间带, 位于两层percoll 间, 主要含肝窦内皮细胞; 第三层中含贯穿整个50%percoll 的枯否细胞; 最底层以肝细胞和血细胞为主。收集下层percoll 用等体积P BS 液稀释, 4℃900g 离心10m in, 沉淀用不含血清的
RP M I 21640液洗涤两遍, 最后用于不含血清的RP M I 21640重
悬接种于玻璃培养瓶。取一滴用于记数。
1. 6 选择性贴壁法进一步纯化
从而影响KC 功能; 离心淘析技术[2, 3]分离可获得较高的产量和活性的KC, 但设备昂贵, 条件严格, 难以推广开展等。由于种系差异, 若能获得人体KC, 则对肝脏疾病发生展机制
肝非实质细胞中, 枯否细胞贴壁能力强, 速度快, 用不含
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分其它肝非实质细胞, 但部分肝窦内皮细胞和肝星状细胞等密度与KC 交叉, 因此经percoll 梯度离心后获得的KC 仍含有少量其它细胞, 且这些细胞均具有贴壁效应[7], 但贴壁速度不同, 对培养底物及培养基要求也不同, 根据贴壁时间及培养条件差异, 将最后分离获得KC 接种于普通玻璃培养瓶, 在细胞接种后60m in, 弃上清液即可除大部分非贴壁细胞如肝窦内皮细胞等, 纯度可达80%。培养24h 后纯度可达90%, 文献中报道贴壁20m in 左右换液去除未贴壁细胞, 纯度可达95%, 但获得的KC 数量会下降[7]。
通过吞噬实验等证实分离所得贴壁细胞即为KC, 并且这在大鼠中通过墨水示踪法得到地进一步证这实。在体外培养过程中, KC 数量并不能随培养时间延长而增多, 在培养第6天即出现较多吞噬颗粒, 至第10天时贴壁能力显著降低, 及时换液去除坏死崩解细胞可减少KC 中的吞噬颗粒。
总之, , 离体酶的方法, 在细胞得率、纯分离时间短。] Malarkey D E, Johns on K, Ryan L, et al . New insights int o func 2
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[6] 张 森, 万德森, 肖锡宾. BALB /c鼠枯否细胞的分离培养与鉴
进行细胞和分子生物学研究具有重要意义, 由于供体的的普遍缺乏, 从整肝上分离人KC 显然不现实, 故建立从手术切除肝组织中分离纯化KC 的方法, 则有较大的实用价值。
本实验中大鼠首先注射肝素抗凝, 然后通过在液体灌注去除血液, 同时将肝脏完整分离, 并将肝周交通血管支结扎, 备灌注胶原酶用; 人体肝组织从肝脏断面基底部血管(肝静永) 插管, 灌注前灌流液; 通过该种方法可以较彻底的将肝脏中的红细胞等冲洗干净, 避免红细胞残留对后续KC 分离的影响。肝脏离体后灌注胶原酶使肝脏充盈膨胀, 可反复循环灌注充盈多次, 直至肝组织变软塌陷后, 去处结缔组织, 过滤收集肝细胞悬液。本实验与原位酶循环灌注法相比, 体外酶循环灌注可显著节约胶原酶用量, 每次每只大鼠需1%胶原酶40m l, 反复灌注既可缩短灌注时间, 又可获得较好消化效果。
链霉蛋白E 具有选择性细胞毒作用, 较多文献报道将其应用于去除混杂的肝实质细胞, 以达到纯化肝非实质细胞目的[2, 6, 7]。但其破坏肝实质细胞后, 导致细胞悬液中出现大量絮状物, 严重影响KC 的获得率; 并且链霉蛋白E 破坏细胞的同时, 也可破坏KC 表面C D14分子, 影响KC 功能
[8]
。本实验中, 仅用胶原酶灌注消化和KC 密度差异, 分。用50g 、3m in 5005in 离心获得肝非实质细胞。重复三次, , 注意每次离心前, 都要将沉淀充分吹打成单细胞悬液。
在KC 的percoll 梯度离心纯化中, 传统[7]percoll 组成在离心管中由上向下依次为:P BS 重悬的肝非实质细胞悬液、
25%percoll 、50%percoll, 如果肝非实质细胞悬液中细胞密
度过高, 则离心过程中在肝非实质细胞悬液和25%percoll 界面之间易形成絮状物薄层, 影响KC 等高密度细胞在离心过程中下沉, 降低分离效果。根据等密度梯度离心原理, 离心过程中, 肝非实质细胞在强离心力作用下, 通过密度逐渐增高的介质沉降, 当到达某一沉降距离, 细胞密度恰好等于梯度介质密度时, 细胞不再沉降, 处于相对平衡状态, 在梯度液特定位置形成区带, 而对于细胞碎片等成份, 密度较低不能渗入percoll 中而处于离心管液最顶层。本实验经过反复摸索, 将最后离心获得的肝非实质细胞用25%percoll 重悬, 形成新的percoll 梯度, 由上向下为:P BS 、含肝非实质细胞的
25%percoll 、50%percoll 。此种方法在离心过程中, 密度相
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对较高的KC 直接沉降至50%percoll 密度层, 从而提高KC 获得率。
利用percoll 梯度离心纯化, 可去除混杂在KC 中的大部
(本文编辑 朱立新)