蛋白质测定
蛋白质含量的测定
注意事项:比色皿用完一次后清洗干净用75%-95%乙醇,防止反应物粘在比色皿上,测定时候时间一定要准确。
一、实验原理
样品蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝显色法,蛋白质分子具有-NH 3+基团,当褐色的考马斯亮蓝G-250显色剂加入蛋白质标准液或样品中时,考马斯亮蓝G-250染料上的阴离子与蛋白-NH 3+结合,使溶液变为蓝色,通过在595 nm处测定吸光度计算出蛋白质含量。
二、试剂配制
考马斯亮蓝G-250工作液:精密称取考马斯亮蓝G-250 10 mg,加入95%乙醇5mL ,使之溶解,再加入85% 磷酸10 mL,混匀,用蒸馏水定容至100ml 的容量瓶中,至于棕色瓶中备用;
蛋白质标准溶液:精密称定牛血清白蛋白50mg ,以生理盐水溶解,定容至100 mL,得0.5 mg/mL的标准溶液。
三、标准曲线测定
取蛋白质标准溶液,生理盐水适量稀释,得到浓度分别为50、100、150、200、250、300μg/mL的标准溶液,取上述标准溶液各0.1 mL,加入考马斯亮蓝工作液1.0 mL,混匀,室温反应1min ,于595 nm波长处测定吸收值
四、肾脏组织:
样品测定:组织匀浆制备:将组织从-20 ℃冰箱中取出,用预冷的生理盐水反复冲
洗洗剔除脂肪和结缔组织,用滤纸吸干表面水分后剪碎,精密称取1 g组织,加入重量9倍体积的预冷的生理盐水,用超声粉碎仪粉碎制成10%组织组织匀浆,6000 r/min,4 ℃离心30min ,制得10%组织匀浆上清液用于指标的测定。取待测血清或匀浆溶液10µl 用生理盐水稀释到1ml ,取上述血清或者组织匀浆0.1ml ,加入考马斯亮蓝工作液1.0 mL,混匀,室温反应3min ,于595 nm波长处测定吸收值,带入标准曲线计算蛋白质浓度,必要时将样品液做适当倍数稀释。