葡萄遗传转化体系研究进展

博士□ 兽医硕士专业学位□

硕士■ 农业推广硕士专业学位□

同等学力在职申请学位□ 中职教师攻读硕士学位□

工程硕士专业学位□ 高校教师攻读硕士学位□ 风景园林硕士专业学位□

西 北 农 林 科 技 大 学

研 究 生 课 程 考 试 试 卷 封 面

（课程名称： 高级果树学专题 ）

学位课□ 选修课■ 补修课□

研 究 生 年 级、姓 名 2010级 向江

所 在 学 院 及 专 业 园艺学院 果树学

任 课 教 师 姓 名 范崇辉

考 试 日 期 2011年5月30日

考 试 成 绩

评 卷 教 师 签 字 处

葡萄遗传转化体系研究进展

向江

（西北农林科技大学园艺学院 陕西 杨凌712100）

摘要：通过大量文献阅读，从葡萄遗传转化的基因、遗传转化途径、遗传转化受体、遗传

转化应用及提高转化效率的方法等方面对葡萄遗传转化体系的研究进展进行了具体的概述，旨

在通过概括性的总结分析前人的研究结果得出经验并从中找出新的突破点，为提高葡萄品质打

下基础，为以后的科学研究探寻道路。

关键词：葡萄；遗传转化；转化效率；抗病

中图分类号： 文献标识码：A 文章编号：0513-353X

Research Progress Of Grape Genetic Transformation System

Xiang Jiang

（College of Horticulture Northwest University of Agriculture and Forestry Yangling 712100, Shaanxi P.R. China）

Abstract: Through extensive literature reading, gave a summary of grapes genetic transformation system research progress from the aspects of the gene of grapes genetic transformation, way of genetic transformation, receptor of genetic transformation, application of genetic transformation and how to improve the efficiency of genetic transformation. Aiming to find new breakthrough from the research of predecessors and find a way for the later scientific research .

Key words: grape; genetic transformation; efficiency; disease resistance

[1]葡萄是一种多年生的藤本植物，其栽培面积和产量均位于果树的第二位，作为世界四

大水果之一，葡萄以其独有的特性深受欢迎。在我国，葡萄的栽培面积正逐年扩大。随着酿酒工业的不断崛起，酿酒葡萄的栽培正在逐年扩大并推广。然而，由于葡萄的生长周期较长，其育种周期亦很长，给科研及生产带来了不便。基因工程的产生为葡萄的遗传转化带来了很大的方便，大大缩短了育种年限。遗传转化是基因工程的关键一步，直接关系到基因工程的成果能否运用于生产中。但是由于葡萄基因数量多且多呈杂合状态，限制了分子育种的开展。因而，葡萄的转基因遗传转化研究工作难度较大，常常无法获得转基因再生植株或只获得少

[2]数再生植株。直到20世纪90年代, 随着分子生物学研究的深入和转基因技术的日趋成熟,

[3] [4][5] 才在葡萄遗传转化体系等方面有了较多工作。陈力耕等、周鹏等 、孙仲序等、韩继

[6]成等 先后在葡萄遗传转化工作上获得了成功，为葡萄遗传转化工作奠定了基础。从此，葡萄遗传转化受到了普遍重视，许多学者开始进行葡萄遗传转化的研究。

1. 葡萄遗传转化基因

目前, 葡萄遗传转化导入的基因多为报告基因，近年也成功地导入了少量有重要经

[14、15][16] 济价值的目的基因，其中包括GFLV( 葡萄扇叶病毒) 、西红柿斑点病毒、GCMV ( 葡

[17][18]萄铬黄花叶病毒） 的CP( Coat Protein)基因, B.t.(苏云金杆菌)杀虫蛋白基因及几丁质酶[ 7-13]

基因。虽然成功导入葡萄的目的基因的数量和种类还很少,但是目前为止，已有大量可以用

[19][20][21]于遗传转化的基因，包括几丁质酶基因，溶肽酶基因，溶菌酶基因 等基因。只是由

于对葡萄进行遗传转化困难，从而限制了基因工程育种的发展。因此，研究高效的遗传转化

[1] 系统是当前葡萄基因工程育种中迫切需要解决的问题。

2. 葡萄遗传转化的途径

2.1Ti 质粒做载体感染葡萄

质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上，是重组DNA技术中重要的工具。由于遗传转化

[1]后多存在嵌合体，对于用质粒作为遗传转载体的途径的研究有一定限制。1989年，李云等

用改进的Ti质粒做载体感染葡萄茎尖，获得了转化体。为葡萄遗传转化体系的建立提供了可供参考的条件。

2.2根癌农杆菌介导的遗传转化

根癌农杆菌能在自然条件下趋化性地感染140多种双子叶植物或裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。根癌农杆菌的Ti质粒上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系，被

[22]誉为“自然界最小的遗传工程师”。一些学者在作了一些探索，并获得可喜的成果。L.

Martinelli等人用根癌农杆菌作为介导，将抗RUGOSE木疾病复合体基因导入葡萄内，通过再

[23]生培养使其得到表达。Gall 等(1994) 以葡萄砧木110 Richter 花粉诱导的体细胞胚与携

[17]带有GCMV-CP 基因的农杆菌共培养, 获得了转基因株。Mauro 等(1995) 用砧木品种41B

和S04 以及一个欧洲葡萄的花粉胚性细胞悬浮液与农杆菌共培养, 成功地将GFLV的CP基因

[15]导入再生植株体内。Krastanova 等(1995) 通过农杆菌系LBA4404 将GFLV-FB的CP基因导

[14]入了沙地葡萄和110Richter花粉的胚性愈伤组织和成熟胚的下胚轴碎片中，得到再生植株。

由于根癌农杆菌的种种优点，其在葡萄遗传转化体系中也扮演着重要的角色。具有不可动摇的地位。

2.3发根农杆菌介导的遗传转化

发根农杆菌诱导产生发状根，其特征是大量增生高度分支的根系。其Ri质粒上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，可以通过将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移和整合，然后通过细胞和组织培养技术，得到转基因植物。对此，研究人员也进行了研究和探索。迄今为止，采用发根农杆菌介导的遗传转化途径仅 Nakano 等(1994) 用来自叶片的体细胞胚与发根农杆菌共培养，获得了一例转基因株，并发现该转基因株分枝多、矮

[12]化、卷叶、具变化的花型和生成大量的根。发根农杆菌不仅可作为遗传转化的载体，还可

以作为某些农艺上感兴趣品质的基因来源。但是，对于葡萄来说，由发状根诱导的组织再生能力较差，因此，用发根农杆菌进行遗传转化时，应选择那些易于从根再生出植株的葡萄品种。

2.4基因枪法用于普通遗传转化体系

单独运用基因枪法对葡萄进行遗传转化的报道很少，仅Hebert 等在1993年报道用裹有GUS 和NPTII基因的微粒轰击杂种葡萄Chancellor 的胚性培养物, 获得了转基因愈伤组织, 但未得到再生植株，直到1995年，Hebert 等才从此种愈伤组织中再生出植株，并经Southern

[31]检测证实NPT II基因确实导入了转基因植株体内。Hebert等认为基因枪是一个有效的转化

杂种葡萄Chanaller的方法，可能对某些葡萄品种非常适合，但还有待于进一步实验。

基因枪法与根癌农杆菌相结合，是一种对葡萄进行遗传转化较为有效的措施。Scorza等(1995)以无核葡萄未成熟的合子胚中诱导产生的体细胞胚为试材，体细胞胚先被基因枪轰击

二次，然后与农杆菌共培养(含NPT II基因、GUS基因)，最后经Southern检测获得了转基因

[13]株 。1996 年，Scorza 等又用1um金弹轰击由无核白试管苗叶片产生的体细胞胚，轰击两次后再与农杆菌共培养，最后经Southern 检测证实溶菌酶Shirva-1基因或西红柿斑点病毒的CP 基因已导入转基因植株体内。由上述研究可知基因枪的轰击大大提高了葡萄与农杆菌共培养试材的转化效率，应进一步研究和推广。

2.5超声波辅助的农杆菌介导遗传转化方法

超声波辅助的农杆菌介导遗传转化方法是一种在超声波处理条件下所进行的农杆菌介导的遗传转化方法。1997年超声波辅助的农杆菌介导法首次在大豆的遗传转化中得到应用

[29][30][31][32]。目前, 该方法已经广泛应用到洋槐，黄瓜，七叶树等植物的遗传转化中，其转化效率显著高于单纯农杆菌介导法。在葡萄遗传转化研究方面，目前超声波辅助农杆菌介导

[32]法在葡萄遗传转化中应用较少，2010年，周蓓蓓等人将超声波辅助农杆菌介导转化应用于

“美人指”葡萄，使得转化效率得到了很大的提高，其原理为超声波处理对外植体细胞空化和微机械损伤作用，使外植体细胞壁局部破损，改变细胞质膜的通透性，从而为细胞内外物

[33]质的交换创造条件。

3. 葡萄遗传转化的受体

在葡萄遗传转化过程中，常用葡萄胚体细胞系作为遗传转化的受体细胞也有研究

[38,39]人员用叶细胞或茎段细胞作为受体。获得转基因株是植物遗传转化的最终目的，无论采

取何种转化方法，最终都要通过外植体再生途径得到转化植株。同其它植物比较，葡萄的再生比较困难，存在再生率低、重复性差等问题，探索高效再生措施是葡萄遗传转化的首要任务。

3.1用葡萄胚体细胞系作为受体细胞

胚状体转化的途径是植物遗传转化中一条基本的再生途径。该途径不但可使细胞与农杆菌充分接触，产生大量的转化细胞，同时可以和抗生素更好地紧密接触，减少逃脱筛选的细胞，而且一般认为胚状体源于单个细胞，因此胚状体发生途径更易于产生均一的转化克隆。此外,由于胚性细胞比叶片、茎段、叶柄等具有较高的再生能力，转基因葡萄植株大多是通

[ 40-44]过胚状体发生途径获得的。2003年，贺红等人通过以枳壳实生苗上胚轴为转化外植体，

农杆菌Ti 质粒上插入了外源目的基因—柑桔衰退病病毒外壳蛋白基因(CTV-cp)，转化植株用GUS (葡萄苷酸酶) 染色及PCR进行鉴定。结果，分析证实外源目的基因已整合到枳壳转化株的核基因组中。成功地建立了农杆菌介导的枳壳转化系统，为利用基因工程的手段进行枳

[45]壳的抗病育种奠定了基础。也为葡萄胚细胞体系作为受体提供了方向。2007年，邓杰等人

为建立葡萄遗传转化技术体系，以霞多丽葡萄(Chardonnay) 胚性细胞系为靶组织，采用GUS检测法，对影响农杆菌介导葡萄遗传转化效率的主要因素进行了研究。确立了农杆菌介导葡萄胚性细胞系遗传转化的几个最适影响因素，从而为葡萄遗传转化技术体系的建立奠定了基础。

但胚状体的诱导存在很大的困难。葡萄的基因型是胚状体诱导的制约因素，目前仅从部分葡萄品种中诱导产生了胚状体，胚状体的发生也受到外植体的种类和生理状况的影响，花药和合子的胚较容易产生胚状体，叶片，叶柄不易再生出体细胞胚，而卷须更难产生体细胞胚；另外，体细胞胚的诱导过程繁琐，诱导过程漫长，而且诱导率普遍较低，最终的成苗率小于5%，上述因子限制了胚状体诱导途径的进一步发展；此外，体细胞胚的萌发率低也是这

[45, 46,47]一再生途径中急需解决的问题。反过来讲，葡萄体细胞胚可保持较长时期的发生能力，

这一优点为葡萄遗传转化创造了有利条件。

3.2器官发生途径进行葡萄遗传转化

[43, 44]许多学者通过器官发生途径获得了较高频率的不定芽，但到目前为止通过这种途

径获得的葡萄转基因植株全为嵌合体。Colby等(1991) 对与农杆菌共培养的叶片进行解剖学

[51] 和组织化学分析，发现直接的器官发生会产生嵌合的转基因株。一般认为这是由于不定

芽源于多个细胞，其他许多学者也先后以叶柄、叶片、茎段、茎尖碎片与农杆菌共培养，再

[51, 52]生不定芽均为嵌合体，这个结果证明Colby(1991) 的结论是正确的。尽管至今未见有再

生出均一的转基因葡萄植株的报道，但在其它植物遗传转化中，器官发生途径是获得转基植株的基本方法之一，并且器官发生途径的再生过程简便，更易获得再生植株，因此，今后的研究应该在减少或不发生嵌合体方面加大力度。

4. 葡萄遗传转化体系的应用

对葡萄进行遗传转化主要是为了克服葡萄栽培品种的某些不足，以期对葡萄进行遗传改良，使其产生有利的性状，增强葡萄对不良外部环境的适应性和抗逆性。目前对葡萄的遗传

[53-58][59-62][63]转化主要应用于葡萄抗病性改良和抗除草剂改良及抗冻性改良等方面。

4.1抗病性葡萄遗传转化

抗病性葡萄遗传转化体系的建立是为了克服葡萄的某些抗病能力差等因素，人为的将某些基因导入到葡萄受体细胞内，培养生长出再生体系，从而达到抗病性育种的目的。目前应

[53,54][55，56]用葡萄遗传转化的抗病性主要有抗真菌病害转化，抗病毒病害转化和抗细菌病害转

[57]化。

4.1.1抗真菌性病害的应用

真菌病原体是影响葡萄生长发育的主要问题，尤其是灰霉菌引起的灰霉病在智利和其他世界葡萄产区是最严峻和困难的。在葡萄转基因遗传转化过程中，对真菌病害的防止和转化

[64]占了一大部分，也取得了相应的成果。J.R. Kikkert等人通过基因枪转殖技术表达美乐和霞

多丽葡萄内的真菌几丁质酶，并用GUS (葡萄苷酸酶)染色及PCR进行鉴定，最后通过实验证实，该酶基因转入葡萄体内，从而为白粉病及木霉病等真菌性疾病的抗逆性转化提供了一定的基础。P.Hinrichsen等人用哈茨木霉制剂和抗菌剂缩氨酸基因对葡萄真菌耐受性进行遗传转化，并通过绿色荧光蛋白及PCR检测对葡萄转化效率进行了检测，进一步推动了葡萄抗真菌病害的研究。

4.1.2 抗病毒病害的葡萄遗传转化应用

[68-70]对于病毒病害的抗性改良研究，学者们也做了较多的尝试。但研究成果并不太显著，

O.Le Gall等人通过土壤农杆菌介导葡萄胚状体遗传转化及转基因植株的再生及表达GCMV病毒壳蛋白，病通过转化及表达，研究葡萄对GCMV病毒的抗病性。

4.1.3 抗细菌病害的改良

在抗细菌病害的改良方面，目前的报道还很少见，研究很少，这也许是以后研究的一个方向，为葡萄遗传转化提供了思路。

4.2 抗除草剂遗传转化应用

有人对葡萄进行了抗除草剂遗传改良，以期可以找到高除草剂抗性的葡萄植株，为葡萄园管理提供方便。B.A. Levenko等人用抗除草剂转基因改良赤霞珠葡萄，结果发现经过体外适应，转基因植株可以在喷施除草剂剂量为10ml/l的条件下存活，而在一般情况下，未经转基因的植株在除草剂浓度达到3ml/l时就会被杀死。这一研究的发现为改良葡萄作出了很大贡献，为以后研究提供了理论依据。

4.3 抗冻性改良

对于我国大部分地区而言，冬天极低的温度是影响葡萄正常生长的重要因素，通过遗传转化地方法将抗冻基因导入葡萄体内，培育抗冻性较强的葡萄，是一项意义深远的探索。而对于遗传改良葡萄抗冻性的研究方面，目前还少见报道，可作为一个方向进行深入探讨。

5. 影响遗传转化效率的因素

径获得的葡萄转基因植株全为嵌合体。Colby等(1991) 对与农杆菌共培养的叶片进行解剖学

[51] 和组织化学分析，发现直接的器官发生会产生嵌合的转基因株。一般认为这是由于不定

芽源于多个细胞，其他许多学者也先后以叶柄、叶片、茎段、茎尖碎片与农杆菌共培养，再

[51, 52]生不定芽均为嵌合体，这个结果证明Colby(1991) 的结论是正确的。尽管至今未见有再

生出均一的转基因葡萄植株的报道，但在其它植物遗传转化中，器官发生途径是获得转基植株的基本方法之一，并且器官发生途径的再生过程简便，更易获得再生植株，因此，今后的研究应该在减少或不发生嵌合体方面加大力度。

4. 葡萄遗传转化体系的应用

对葡萄进行遗传转化主要是为了克服葡萄栽培品种的某些不足，以期对葡萄进行遗传改良，使其产生有利的性状，增强葡萄对不良外部环境的适应性和抗逆性。目前对葡萄的遗传

[53-58][59-62][63]转化主要应用于葡萄抗病性改良和抗除草剂改良及抗冻性改良等方面。

4.1抗病性葡萄遗传转化

抗病性葡萄遗传转化体系的建立是为了克服葡萄的某些抗病能力差等因素，人为的将某些基因导入到葡萄受体细胞内，培养生长出再生体系，从而达到抗病性育种的目的。目前应

[53,54][55，56]用葡萄遗传转化的抗病性主要有抗真菌病害转化，抗病毒病害转化和抗细菌病害转

[57]化。

4.1.1抗真菌性病害的应用

真菌病原体是影响葡萄生长发育的主要问题，尤其是灰霉菌引起的灰霉病在智利和其他世界葡萄产区是最严峻和困难的。在葡萄转基因遗传转化过程中，对真菌病害的防止和转化

[64]占了一大部分，也取得了相应的成果。J.R. Kikkert等人通过基因枪转殖技术表达美乐和霞

多丽葡萄内的真菌几丁质酶，并用GUS (葡萄苷酸酶)染色及PCR进行鉴定，最后通过实验证实，该酶基因转入葡萄体内，从而为白粉病及木霉病等真菌性疾病的抗逆性转化提供了一定的基础。P.Hinrichsen等人用哈茨木霉制剂和抗菌剂缩氨酸基因对葡萄真菌耐受性进行遗传转化，并通过绿色荧光蛋白及PCR检测对葡萄转化效率进行了检测，进一步推动了葡萄抗真菌病害的研究。

4.1.2 抗病毒病害的葡萄遗传转化应用

[68-70]对于病毒病害的抗性改良研究，学者们也做了较多的尝试。但研究成果并不太显著，

O.Le Gall等人通过土壤农杆菌介导葡萄胚状体遗传转化及转基因植株的再生及表达GCMV病毒壳蛋白，病通过转化及表达，研究葡萄对GCMV病毒的抗病性。

4.1.3 抗细菌病害的改良

在抗细菌病害的改良方面，目前的报道还很少见，研究很少，这也许是以后研究的一个方向，为葡萄遗传转化提供了思路。

4.2 抗除草剂遗传转化应用

有人对葡萄进行了抗除草剂遗传改良，以期可以找到高除草剂抗性的葡萄植株，为葡萄园管理提供方便。B.A. Levenko等人用抗除草剂转基因改良赤霞珠葡萄，结果发现经过体外适应，转基因植株可以在喷施除草剂剂量为10ml/l的条件下存活，而在一般情况下，未经转基因的植株在除草剂浓度达到3ml/l时就会被杀死。这一研究的发现为改良葡萄作出了很大贡献，为以后研究提供了理论依据。

4.3 抗冻性改良

对于我国大部分地区而言，冬天极低的温度是影响葡萄正常生长的重要因素，通过遗传转化地方法将抗冻基因导入葡萄体内，培育抗冻性较强的葡萄，是一项意义深远的探索。而对于遗传改良葡萄抗冻性的研究方面，目前还少见报道，可作为一个方向进行深入探讨。

5. 影响遗传转化效率的因素

遗传转化的效率受到多方面因素的影响，受体与再生系统的影响、辅助条件的影响、 培养方法与培养条件的影响等都极大程度的影响着遗传转化的效率。

5.1受体与再生系统的影响

合适的转化受体及转化细胞的有效再生是转基因植株的获得依据。合适的转化受体首先具有要容易再生的条件，要有高效稳定的再生能力。因此，在进行转化之前选择易于再生的外植体建立有效的再生体系是十分必要的。其次，具有再生能力的细胞要对农杆菌敏感且能接触到农杆菌葡萄常用的转化受体主要为合子胚、体胚、胚性愈伤组织、悬浮细胞等。葡萄不同外植体的转化结果表明，体细胞胚比叶片好，具有很强的接受外源基因的能力，转化率高。

5.2辅助条件的影响

在葡萄的遗传转化过程中，加入一些辅助条件如，超声波辅助及基因枪法等，可以提高遗传转化效率。超声波处理对外植体细胞空化和微机械损伤作用，使外植体细胞壁局部破损, 改变细胞质膜的通透性，从而为细胞内外物质的交换创造条件。

5.3培养方法与培养条件的影响

5.3.1乙酰丁香酮对转化效率的影响

[68]有许多报道表明,乙酰丁香酮可以促进农杆菌对植物基因组的遗传转化。乙酰丁香酮

[69]能活化农杆菌Ti质粒毒性区, 促进T- DNA 的转移，从而提高转化率。邓杰等的实验结果

也证实，AS能促进农杆菌介导葡萄胚性细胞系的遗传转化效率，在共培养基中添加100umol/L AS时,促进了T-DNA转化，显著提高了GUS的瞬时表达效率。

5.3.2抗氧化剂对转化效率的影响

[45]Olhoft 等认为，在农杆菌介导的植物遗传转化中，常常会引起外植体的褐化和细胞

死亡，而这种褐化和细胞死亡可能会阻碍T-DNA进入植物细胞，进而降低植物遗传转化效率， 当在共培养基中加入L- Cystine 时，有效降低了大豆子叶节组织褐化的现象。后来，他们又

[24]发现在共培养基中加入二硫苏糖醇(DTT)和硫代硫酸钠时，更加有效地提高了转化效率。

他们推测，这些巯基混合物之所以提高TDNA的转移效率可能是由于它们抑制了植物因创伤而发生褐化反应的酶的活性。邓杰等的验结果也表明，在共培养基中加入3mg/LDTT时，也有效提高了T-DNA的转化效率。

本文通过文献查阅，概述了迄今国内外葡萄遗传转化的研究进展，包括葡萄遗传转化的基因、遗传转化途径、遗传转化受体、遗传转化应用及提高转化效率的方法等方面。遗传转化是为了改良葡萄的性状，使之有利于环境和健康，这是大众能够接受葡萄遗传转化的关键。转基因食品的安全性问题在世界范围内倍受关注，正在开展许多有关的研究工作，但转基因食品是否被公众接受还是一个未知的问题。因此，葡萄遗传转化的研究方面，还应解决公众接受与否的问题。

References

[1] 李云,冯慧,田砚亭. 葡萄再生系统研究进展[J]. 生物技术通报, 2000,(02) 49-52

[2] 杨丽娜,刘捷,庄智敏,章镇,周蓓蓓,陶建敏,. 根癌农杆菌介导Barnase基因转化‘美人指’葡萄的研究[J]. 南京农业大学学报,2009,(1).31-35

[3] 陈力耕, 刘淑芳, 胡西琴. 葡萄高效再生体系的建立及转LEAF Y基因的研究[J]. 浙江大学学报: 农业与生命科学版, 2001，27(5): 523- 526

[4]周鹏, 王跃进, 贺普超. 人胰岛素样生长因子-∋基因转化葡萄的研究[J].热带作物学报, 2002, 23 (1) : 54 - 61

[5]孙仲序, 陈受宜, 王建设, 等. 农杆菌介导BADH 基因转化葡萄的研究[J].果树学报, 2003, 20(2) : 89- 92

[6] 韩继成, 陈宁, 陈霜莹, 等. 不同处理对无病毒葡萄离体叶片遗传转化的影响[J] . 分子植物育种, 2006,4 (5) : 670 - 674

[7] Berres R et al. Plant Cell Report s, 1992, 11: 192- 195.

[8] Colby S M et al. J. Amer. S oc. Hort. S ci. , 1991, 116( 2 ) : 356-361.

[9] Franks T et al. Molecular Breeding, 1998, 4: 321- 333.

[10] Mart inelli L et al. Th eor, Appl. Genet . , 1994, 88: 621- 628.

[11] Mullins M G et al. Bio/ T echno, 1990, 18: 1041- 1045.

[12] Nakano M et al. J. Exp. Bot . , 1994, 45: 649- 656.

[13] Scorza R et al. Plant Cell report s, 1995, 14: 589- 592.

[14] Krast anova S et al. Plant Cell Report s, 1995, 14: 550- 554.

[15] Mauro M C et al. Plant Science, 1995, 112. 97- 106.

[16] Scorza R et al. J. Amer. Soc. Hort. Sci. , 1996, 121( 4) : 616-619.

[17] Gall O L et al. Plant Science, 1994, 102: 161- 170.

[ 18] 张克忠等. 实验生物学报, 1997, 30( 3) : 303- 308.

[19] Lund P et al. Plant Mot . Biol. , 1992, 18: 55- 67.

[20] Jaynes J M et al. Plant S cience, 1993, 89: 43- 53.

[21] T rudel J et al. Plant Science, 1992, 87: 55- 67.

[22]T.A.Brown著，魏群 译.2006. Gene Cloning and DNA Analysis - An Introduction（5th edition）.北京：高等教育出版社

[23] L. Martinelli et al. 1998 – ISHS

[24] KRASTANOVA S, PERRIN M, BARBIER P. Transformation of grapevine rootstocks with coat protein gene of grapevine fanleaf neprovirus[J]. Plant Cell Reports, 1995, 14: 550- 554.

[25] CHEN Li- geng, LIU Shu- fang, HU Xi- qin. Development and studieson LEAFY genetic transformation system with high efficiency in commercial g rape[J]. Journal of Zhejiang Agricultural University, 2001, 27(5): 523- 536.

[26] ZHOU Peng, WANG Yue- jin, HE Pu- chao. Transfer of the huIGF-Ⅰ gene into grapes[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2002, 23 (1): 54- 61.

[27] MAMOTO T, IKETANI H, IEKI H, NISHIZAWA Y, NOTSUKA K, HIBI T, HAYASHI T, MATSUTA N. Transgenic grapevine plants expressing a rice chitinase with enhanced resistance to fungal pathogens[J]. Plant Cell Reports, 2000, 19: 639- 646.

[28] BROGLIE K, CHET I, HOLLIDAY M. Transgenic plants with enhanced resistance to the Fungal Pathogen Rhizoctonia solani[J]. Science, 1991, 254: 1194- 1197.

[29] TRICK H N, FINER J J. SAAT: sonication- assisted Agrobacteriummediated transformation[J]. Transgenic Research, 1997, 6:329- 336.

[30] OLHOFT P M, SOMERS D A. L- cysteine increase Agrobacteriummediated T- DNA delivery into soybean cotyledonary- node cells[J]. Plant Cell Reports, 2001, 20, 706- 711.

[31] Hebert S oule D et al. Plant Cell Report s, 1995, 14( 6) : 380-384

[32] 李金凤. rolC 基因转化葡萄砧木5'BB '的研究[ D ]. 南京: 南京农业大学, 2007

[33] 王关林,方宏筠.植物基因工程(第二版) [M ] . 北京: 科学出版社, 2002.

[34] 孙仲序,陈受宜,王建设,李桂芬,管雪强. 农杆菌介导BADH基因转化葡萄的研究[J]. 果树学报, 2003,(02) .

[35] 王华,张继澍,卢江,马春花. 葡萄基因工程研究进展[J]. 西北植物学报, 2004,(09)

[36] 李云,冯慧,田砚亭. 葡萄再生系统研究进展[J]. 生物技术通报, 2000,(02)

[37] 张文娥,王飞,潘学军. 葡萄属植物(Vitis L.)再生系统的研究进展[J]. 西北农林科技大学学报(自然科学版), 2003,(S1)

[38] Regner F. Mit teilungen Klost erneubrug, 1994, 44 ( 5 ) : 168 -174.

[39] Torregrosa L et al . Plant Cell, Tissue and Organ culture, 1996, 45: 245- 252.

[40] Vivier, M.A. and Pretorius, I.S. (2000) Geneticimprovement of grapevine: tailoring grapevarieties for the third millennium. S. Afr. J. Enol. Vitic. 21, 5–26

[41] Spies, P.H. (2001). Vision 2020: A strategic outlinefor the South African wine industry – a road mapfor future competitiveness. Winetech report forthe South African wine industry. (Available athttp://www.winetech.co.za)

[42] Colova-Tsolova, V. et al. (2001) Geneticallyengineered grape for disease and stress tolerance. In Molecular Biology and Biotechnology of theGrapevine (Roubelakis-Angelakis, K.A., ed) pp.411–432, Kluwer Academic Publishers

[43] Kikkert, J.R. et al. (2001) Grapevine geneticengineering. In Molecular Biology andBiotechnology of the Grapevine (Roubelakis-Angelakis, K.A., ed) pp.393–463, Kluwer Academic Publishers

[44]Jackson, R.S. (1994) Grapevine species andvarieties. In Wine Science: Principles andapplication pp.11–31, Academic Press6 Mullins, M.G. et al. (1992) In: Biology of thegrapevine, pp.203–229, CambridgeUniversity Press

[45] Perl A et al. Plant S ci. 1995, 104( 2) : 193- 200.

[46] Popescu C F et al. Plant Grow th Regulat ion, 1996, 20: 75- 78.

[ 47] Salunk he C K et al. Plant Cell Report s, 1997, 17: 12- 67.

[48] Perl, A. and Eshdat, Y. (1998) DNA transfer andgene expression in transgenic grapes. InBiotechnology and genetic engineering reviews (Tombs, M.P., ed) pp.365–389, Intercept Ltd

[49] 陈力耕,刘淑芳,胡西琴. 葡萄高效再生体系的建立及转LEAFY基因的研究[J]. 浙江大学学报(农业与生命科学版), 2001,(05) .

[50] 蔡文启,郭德银,徐绍华,王荣,莽克强. 葡萄扇叶病毒的分离、鉴定、提纯及血清学研究[J]. 植物病理学报, 1990,(02) .

[51] Colby S M et al. J. Amer. S oc. Hort. S ci. , 1991, 116(2) : 356-361.

[52] Mullins M G et al. Bio/ T echno, 1990, 18: 1041- 1045.

[53] 李金凤,陶建敏,糜林,李国平,章镇,. 葡萄砧木5BB超声波辅助农杆菌介导法遗传转化的条件[J]. 江苏农业学报,2009,(5).

[54] 李金凤,杨丽娜,周蓓蓓,章镇,陶建敏,. 葡萄砧木5BB农杆菌介导法的遗传转化体系[J]. 江苏农业学报,2009,(3).

[55] ]沈卫锋,翁宏飚,牛宝龙,何丽华,刘岩,齐晓朋,孟智启,. 根癌农杆菌介导的灰葡萄孢菌遗传转化研究[J]. 遗传,2008,(4).

[56] 金万梅,董静,闫爱玲,王忆,陈梅香,韩振海,. 葡萄器官离体再生和遗传转化体系的建立[J]. 园艺学报,2008,(1).

[57] 刘会宁,李华,. 欧亚种葡萄自交F_1代对白粉病和霜霉病的抗性遗传[J]. 植物保护学报,2004,(1).

[58] 韩继成,陈宁,陈霜莹,章德明,蔡文启,. 不同处理对无病毒葡萄离体叶片遗传转化的影响[J]. 分子植物育种,2006,(5).

[59] Martinelli, L. and Gribaudo, I. (2001) Somaticembryogenesis in grapevine. In Molecular Biologyand Biotechnology of the Grapevine (Roubelakis-Angelakis, K.A., ed) pp.327–352, Kluwer Academic Publishers

[60] Agrios, G.N. (1997) Plant Pathology (4th edn) Academic Press

[61] Bavaresco, L. and Fregoni, C. (2001) Physiologicalrole and molecular aspects of grapevine stilbeniccompounds. In Molecular Biology and Biotechnologyof the Grapevine (Roubelakis-Angelakis, K.A., ed) pp.153–182, Kluwer Academic Publishers

[62] Tattersall, D.B. et al. (2001) Pathogenesis relatedproteins – their accumulation in grapes duringberry growth and their involvement in white wineheat instability. Current knowledge and futureperspectives in relation to winemaking practices. In Molecular Biology and Biotechnology of theGrapevine (Roubelakis-Angelakis, K.A., ed) pp.183–202, Kluwer Academic Publishers

[63] Sanford, J.C. and Johnston, S.A. (1985) Theconcept of parasite-derived resistance – deriving resistance genes from the parasite’s own genome. J. Theor. Biol. 115, 395–405

[64] Loulakakis, K.A. and Roubelakis-Angelakis, K.A. (2001) Nitrogen assimilation in grapevine. InMolecular Biology and Biotechnology of the Grapevine (Roubelakis-Angelakis, K.A., ed)

[65]TRICK H N, FINER J J. SAAT: sonication- assisted Agrobacteriummediated transformation[J]. Transgenic Research, 1997, 6:329- 336.

[66] ZARAGOZAC, MUNOZ- BERTOMEU J, ARRILLAGA I. Regeneration of herbicide- tolerant black locust transgenic plants by SAAT [J]. Plant Cell Reports, 2004, 22: 832- 838.

[67]姚春娜, 王亚馥. 超声波辅助的发根农杆菌对黄瓜的遗传转化 [J]. 园艺学报, 2001, 28(1): 80- 82.

[68] TRICKH N, FINER J J. Induction of somatic embryogenesis and genetic transformation of Ohio buckeye (Aesculus glabra Willd.)[J]. In Vitro Cell Devel Biol Plant, 1999, 35: 57- 60.

[69] JEFFERSON R A. Assaying chimeric genes in plants from gene fusion system[J]. Plant Mol Biol Rep, 1987, 5: 387- 405.

[70]陈立国, 后猛, 王玉海. 农杆菌介导小麦成熟胚愈伤组织的遗传转化研究[J]. 麦类作物学报, 2007, 27(2): 188- 192.