流动相与色谱柱
第一节 流动相
● 甲醇与乙腈 常用做反相流动相的溶剂。
甲醇有其性价比的优势,但是甲醇活性高,可能与某些样品发生反应,而且甲醇在低波长下有紫外吸收,会降低分析方法的灵敏度; 乙腈虽然价格很高,毒性比甲醇大,但是洗脱能力比甲醇强,很少与样品发生反应,用作流动相系统压力要比甲醇低很多,且截止波长比甲醇低20nm ,增加了检测出在低波长下才有吸收的杂质的可能性,
一般倾向于多用乙腈,少用甲醇。但是有时候样品峰形不好或者分离不好,更换溶剂试试是一个很好的选择,毕竟不同的溶剂提供不同的选择性。
● 对流动相的优化
主要在水相上下功夫,水里可以加酸、加碱、加盐,从而改善峰形、提高分离度。
流动相里加碱的情况比较少,主要还是加酸,常用的酸有磷酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸、高氯酸、甲基磺酸等,其中最常用的是磷酸和三氟乙酸。磷酸在低波长下没有紫外吸收,而三氟乙酸在低波长下有,但是三氟乙酸易挥发而磷酸不行,所以单纯做液相,低波长下磷
● PH 值
多数样品在低PH 值下峰形都比中性要好,这个主要是由色谱柱本身的性质所决定的。
色谱柱主要都是硅胶基质,现有的填料处理工艺无法将硅胶上残余的硅羟基全部去除,硅羟基会造成样品峰拖尾,一般认为硅羟基的PKa 在3.5到4.5之间,低pH 值能帮助抑制硅羟基的活性,减小拖尾,从而改善峰形,提高分离度。水溶液中添加0.1%(体积) 的磷酸或者三氟乙酸其PH 值大概在2左右,用作流动相正好抑制硅羟基的活性,所以开发液相分析方法时流动相首选水加01.%的磷酸,然后再以此为基础做优化
● 缓冲盐
缓冲盐的选择原则是:简单、稳定、缓冲能力强、配制简单,需要调pH 值时要有相应的酸或碱。
常用的缓冲盐是磷酸盐,主要是钾盐和钠盐,再有就是醋酸盐,常用的盐浓度在10~20mM左右。以前因为色谱柱填料生产工艺的问题,往往需要在流动相里添加三乙胺来减少拖尾,但是三乙胺对色谱柱的寿命有很大影响,现在新的色谱柱都不再需要了。流动相里有时会需要调节pH 值到碱性,具体pH 要视色谱柱的耐受范围而定,常用 NaOH 、KOH 溶液或氨水做为调节缓冲盐溶液碱性pH 的试剂,也可以往水里单独添加氨水做碱性流动相。
在缓冲盐做流动相时,出峰太早、峰形很差、相似结构的化合物峰因为拖尾或峰型太宽而不能达到基线分离时,可以考虑使用离子对
试剂,常用的离子对试剂主要是各种烷基磺酸钠和四丁基铵盐,但是流动相里使用离子对试剂时,系统需要的平衡时间长,样品保留时间不是很稳定,因为离子对试剂的背景吸收基线会很差,且做完样品后需要长时间清洗,所以我们尽量不使用离子对试剂。
使用缓冲盐时要注意流动相混合以后盐可能析出的问题和盐背景吸收导致基线漂移严重的问题,尤其是在流动相里添加醋酸铵以后,在低波长下梯度变化时基线下降非常严重,严重影响对含量较小杂质的准确定量,可以考虑在乙腈里加入10%的水,水中预先加入10倍水溶液浓度的缓冲盐,这样梯度中A 、B 两项盐的浓度相同,可以避免基线漂移严重的问题。
原料药一般结构式比较大,分子构成比较复杂,开发分析方法时用水加磷酸效果可能效果不好,通常还要求最少尝试2和6.5两个pH 值的磷酸盐缓冲溶液,并依据结果对流动相进行pH 优化,如效果不理想再进一步尝试其它缓冲盐溶液。开发中间体或者IPC 的分析方法时可以根据经验酌情简化流动相的选择过程。
第二节 色谱柱
柱子的选择
目前大部分液相色谱分析都是使用反相色谱柱,其中以C18 和C8柱最为流行。C18和C8柱两者之间并无明显的差别,但在我们实验室中以常使用的是C8柱。 样品的特性 分析方法及色谱柱
碳水化合物(糖类) 反相氨基柱、离子交换法
高纯度、低金属杂质含量的硅胶基质色谱柱是最为实用的色谱柱之一。但传统色谱分析用的硅胶颗粒具有差异性及酸性表面,固定在柱子表面后,导致出现拖尾峰,而且柱与柱之间的重现性较差(2.3)。最近硅胶基质中出现一种新的产品,这种硅胶具有Metal-free 特性,因此柱子性能更稳定,重现性也更好,分离后峰的形状也很不错。这种改性后的硅胶称为B 型硅胶。由于具有上述优点,大多数色谱制造商都用不同的名称来表明它们与传统的产品之间的不同,如Intertsil (日本) 、 BDS(USA)、YMC--Base(USA)等等。大多数色谱柱制造商都生产以B 型硅胶为基质的色谱柱,因此你可以选择你所喜欢的供应商提供的产品。由于这种产品具有上述特性,建议使用A 型硅胶柱的改为使用B 硅胶柱。
柱子尺寸规格的选择
液相色谱分析时柱子选择的另一个因素就是柱子大小、及填充颗粒的直径(dp)的选择。最常用颗粒直径为5μm ,但颗粒的直径(dp)为3.0及3.5μm 的也适合分析使用,但大多数色谱工作者都喜欢使用颗粒直径为5μm 的色谱柱,因为这种色谱柱具有很长的使用历吏。颗粒的dp 小意味着可以获得较高的理论塔板数,但所需的柱压增大,而且dp 为3.0μm 的色谱柱易堵塞,所以一些色谱制造商又生产出dp 为3.5μm 的色谱柱。
在我们实验室中经常使用的是150mm ×4.6mm ,dp 为5μm 的色谱柱。另一种可以选择的色谱柱为75mm ×4.6mm ,dp 为3.5μm 的柱
子,这种柱子的分离效果与前一种色谱柱分离效果相似,但使用时间减小一半。这两种柱子还有一个优点就是在合理的压力下(
1.5ml/min。
有机相的选择
获得成功分离的另一个重要因素就是流动相有机溶剂的选择,如果使用反相色谱柱可以有三种有机溶剂可以选择,甲醇、乙腈和四氢呋喃。每一种溶剂都有其独特的优点,但色谱分析人员很少能预见哪一种溶剂更合适,所以具体选择哪一种溶剂你必须充分考虑同行的意见。
在我的实验室中多数工作分析药物中的成份,其中有些样品的紫外吸收很弱,所以分析时紫外检测器的波长为220nm 甚至更低,但是四氢呋喃的紫外吸收比较强,所以在波长低于240nm 时,就不能选择这种溶剂。尽管低浓度的甲醇在较低的波长下也可使用,但是在低于220nm 时,甲醇的浓度不易控制。选择何种溶剂还必须考虑其与样品
及空气之间不发生作用,而四氢呋喃易分解,形成过氧化物,所以使用这种溶剂时须格外小心。一些研究人员发现,在四氢呋喃中加入
水可以解决这个问题,但它与色谱柱平衡所需的时间比甲醇、乙腈长,而且其不愉快的气味也是一个不利因素。与四氢呋喃相比,甲醇和乙腈的最大优点是在柱压较低的条件下,流速可控制在1-2ml/min之间。
考虑到理想溶剂的特点,如粘度低、紫外吸收弱、与样品不相互作用,而且使用方便,所以首选的有机溶剂应是乙腈,当然利用甲醇作为有机溶剂的也较为常见。
水相的选择
假如样品为一般化合物,可以用水作为水相,然而离子化合物在药物分析时普遍存在,而这类化合物需要控制PH 值才能得到很好的分离。如流动相的PH 值必须高于或低于样品的PKA1.5个单位。在分析有机酸时,当PH 值低于3时,色谱柱一般还比较稳定,然而当PH 值高于8时,就需要缓冲液,因为此PH 值已经超出了二氧化硅的有效使用范围。宽PH 值的二氧化硅柱也比较常见,但是对高PH 值物质的分离,很少有这方面的报道。所以建议使用缓冲液来减少二氧化硅的流失。
考虑到样品的特性及柱子的稳定,建议在分析PH 值较高的物质时应使用缓冲液,2.5mM 的磷酸盐缓冲液 (PH=2.5)是非常合适的水相。如果在分析方法中使用了分光仪,那么就必须选择易挥发的缓冲液,尽管不如真正的缓冲液有用,但0.1% Trifluoroacetic酸和乙
酸能够满足PH 值的控制要求。
其它的因素
在你选择液相色谱的分析方法时,必须考虑到其它的一些因素,比如温度。因为温度变化1度,保留时间将变化1-3%,所以温度控制十分重要,温度的变化还影响色谱柱的选择性,这会使你更积极地投入到温度选择中去。在分析时柱温一般比室温高一点(如35℃) ,因为此温易控制,而且在低压下有利于降低溶剂的粘度,从而降低柱压。有时你需要利用其它的一些方法,如在流动相中加入部分特殊的物质,不过我建议最好在你实在必须时才用这种方法,记住KISS 原则(Keep it simple ,stupid) ,不要使你的流动相过分复杂! HPLC中梯度的优化
梯度优化主要是通过调节流动相的起始比例和梯度的斜率来调整样品的保留时间,优化样品的分离度。有机相起始比例越小,样品保留时间越长,随着梯度的改变,样品出峰的先后顺序也有可能改变。我们做梯度优化时主要调整梯度的起始比例和斜率。现在的色谱柱或者采度优化主要是通过调节流动相的起始比例和梯度的斜率来调整样品的保留时间,优化样品的分离度。有机相起始比例越小,样品保留时间越长,随着梯度的改变,样品出峰的先后顺序也有可能改变。我们做梯度优化时主要调整梯度的起始比例和斜率。现在的色谱柱或者采用了新的封端工艺,或者内嵌极性基团,耐水的能力都比较高。在酸性条件下很多化合物都以离子形式存在,极性较大,为了提高样品的分离度,尽量使用大比例的水做梯度的起始。对于添加缓冲盐的
流动相要注意梯度变化过程中流动相组成改变时不能有盐析出。
对于水加0.1%磷酸的流动相,开始时可以采用95%的水做起始,以95%的有机相结束,注意根据实际情况在梯度最后用大比例的有机相冲洗几分钟,以保证把小极性的杂质洗脱下来,防止样品残留到下一针。梯度的斜率一般采用凹线型的先小后大,梯度变化先慢后快,在此基础上再对梯度进行优化。
使用缓冲盐溶液的梯度水相起始比例一般要从10~20%开始,为了防止盐析出,在梯度最后避免用纯的有机相做冲洗,梯度斜率采用恒定的就可以,在此基础上根据方法运行的情况对梯度进行调整。
一般一个API 的样品采集的时间控制在40~50分钟左右,样品出峰在15~20分钟左右比较好,如果有极性非常小的杂质存在可以在最后加一段时间的大比例有机溶剂冲洗色谱柱,最后再设置10分钟左右的重新平衡时间。中间体和IPC 的样品分析方法时间可以根据需要减半或者时间更短。
具体分析:首先应了解样品的溶解性质,判断样品分子量的大小以及可能存在的分子结构及分析特性,最后再选择HPLC 的分离模式,以完成对样品的分析。 样品的溶解度,由样品在有机溶剂中溶解度的大小,初步判断样品是非极性化合物还是极性化合物,进而推断用非极性溶剂戊烷、己烷、庚烷等,还是极性溶剂二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、乙腈等来溶解样品,并通过实验判断。
若样品溶于非极性溶剂,表明样品为非极性化合物,通常可以选吸附色谱法或正相分配色谱法、正相健合色谱法进行分析。苦样品溶
于极性溶剂或相混溶的极性溶剂,表明样品为极性化合物,通常选用反相分配色谱法或更为广泛应用的反相键合相色谱法进行分析。
若样品溶于水相,可首先检查水溶液的pH 值,若呈中性为非离子型组分,常可用反相(或正相)键合相色谱法进行分析。若pH 呈弱酸性,可采用抑制样品电离的方法,在流动相中加入硫酸、磷酸调节pH=2~3,再用反相键合相色谱法进行分析。若pH 呈弱碱性,则可向流动相中加入阳离子型反离子,再用离子对色谱法进行分析。若pH 呈强酸性或强碱性,则可用离子色谱法进行分析。由于除去固定相中的离子对试剂较慢,当改变流动相时,有时需要长时间的平衡;再由于离子对试剂纯度问题,使离子对中的基线波动问题和干扰问题现象比较常见。
优化条件在于最终色谱图中能产生出最多可分开的谱峰。了解化合物的化学结构,知道是否存在酸或碱,当流动相的pH 值=混合物的平均pKa 值或接近时, 可能会使分离较好。先优化K ; 随着容量因子的增加,谱峰会展宽,峰形变矮。(当所有谱峰符合1<K ;<20的范围时,其流动相已接近最佳了; 再α(≥1.05) ;最后优化N ,不同微粒的柱子均有一个最佳流速,流速再高会降低N 值;如果降低流速,则会增加工作时间,但分离度会更好。当流动相粘度增加时,N 值也将降低;因此尽可能使用低粘度的溶剂。用最小RS 法,另加常识(数一下峰!) ,在大多数情况下将是最佳方案。
至于谱峰拖尾影响因素是很多的,可解决的办法有: 在缓冲不好或离子强度过低的分离中,也会出现保留值重现性差和峰拖尾。增
加缓冲浓度(与样品大小相匹配)能大大改善此情况。
柱子变得严重拖尾,甚至出现双峰,通常是进口滤板发生了部分堵塞或柱进口处出现塌陷(可将空隙填满接着反相冲洗柱子) 。柱子出现峰展宽、拖尾则标志着样品中有保留性极强的“污物”在柱子的进口处堆集起来。样品在柱子上超载能引起峰展宽、拖尾(或伸舌)。通常减少进样量或提高检测器灵敏度。
早出的峰拖尾最甚是仪器存在柱外效应的最好佐证。要排除柱外效应,这不用我来说了吧!
分析酸性或碱性组分,一般必须采用缓冲液流动相。流动相中无缓冲液,样品组分在柱内形成谱带的哪一部分会引起流动相pH 增加或降低,样品组分改变了电离程度,产生峰拖尾。缓冲液除了能改变峰形外,还能改变峰的保留。一般用中等偏高的浓度有利于减少峰拖尾(0.05~0.1mol/L)。 可加适量的修正剂!