有关传染病知识和其临床分析方面的优秀论文 (30)

新型杂多化合物抗禽流感病毒的实验研究

作者：徐坤，侯雷，杨松涛，王宏芳，吴新宇，石明，张秀芝，李娟，夏咸柱 作者单位：

1. 吉林大学公共卫生学院，吉林长春 130021；2. 解放军军事医学科学院军事兽医研究所，吉林长春 130062

【摘要】 目的 探讨新型杂多化合物(PTW)抗禽流感病毒的作用。方法 采用细胞病变法结合MTT法检测PTW对MDCK细胞的毒性和对禽流感病毒(H5N1)的抑制作用；以H5N1感染的小鼠为实验模型，检测PTW对H5N1感染小鼠的治疗作用。结果 PTW对MDCK细胞的最大无毒质量浓度为190.55mg/L，半数致死质量浓度为909.9mg/L；体外实验结果表明PTW对禽流感病毒半数抑制质量浓度(IC50)为13.49mg/L，治疗指数(TI)为67.44；体内实验显示PTW对H5N1感染小鼠有明显的治疗作用，25mg/kg剂量组对H5N1感染小鼠的肺炎抑制率达166.16%，生命延长率为28.36%。结论 PTW对H5N1禽流感病毒具有较好的抑制作用。

【关键词】 禽流感病毒；新型杂多化合物；抗病毒活性

基金项目：吉林省农业重大科技专项课题资助项目(No.20040202 3 1)；全军医学科研“十五”计划第二批课题资助项目(No. 04Z016)

Anti influenza A(H5N1) virus activities ofa novel polyoxometalate in vitro and in vivo

Xu Kun, Hou Lei, Yang Songtao, Wang Hongfang, Wu Xinyu, Shi Ming, Zhang Xiuzhi, Li Juan, Xia Xianzhu

1. School of Public Health, Jilin University, Changchun 130021;

2. Institute of Military Veterinary, Academy of Military Medical Sciences, Changchun 130062, China

ABSTRACT: Objective To study anti influenza virus A (H5N1) activity of a novel polyoxometalate and in vivo. Methods We detected toxicity of the title compound on MDCK and inhibition on H5N1 virus infection by cytopathic effects combined with MTT assay. To understand polyoxometalates therapeutical effect on this virus, we used the mouse model. Mice were infected with H5N1 virus at 5LD50 dose by intranasally inoculation. Results TC0 of the title compound was 190.55mg/L. The title compound showed a significant inhibitory effect on H5N1 compared with that in positive group. In vitro experiment showed polyoxometalates LD50 on H5N1 was 13.45mg/L.Therapy index (TI) of the title compound was 67.40, which was higher than that of AMA. The inhibitory rate of the 25mg/kg group was 166.16%, and prolonged survival rate was 28.36%. Conclusion The novel polyoxometalate has better inhibitory effect on H5N1 virus.

KEY WORDS: bird influenza virus; polyoxometalate; anti virus activity

近年来，高致病性禽流感先后在世界不同国家和地区爆发流行并有蔓延趋势。禽流感不仅感染禽类，在部分国家和地区也已感染人群。禽流感的传染性强、致死率较高，其流行不仅造成巨大的经济损失，而且给人类的健康带来较大的威胁[1]。目前，在世界范围内对禽流感的防治尚缺乏有效的药物。杂多化合物是一类多金属氧簇化合物。研究表明，该类化合物具有多种生物活性，尤其在抗病毒方面显示出较高的活性和选择性[2 3]，文献报道具有keggin结构的杂多化合物对多种RNA病毒均有较好的抑制作用[4 9]。本实验选用吉林大学公共卫生学院合成的新型杂多化合物[polyoxometalat, (C10H18N)5BW12O40·5H2O，PTW]，采用体内、外的实验方法研究PTW的毒性和对禽流感病毒(influenza, virus H5N1)的抑制作用，为开发新型抗H5N1禽流感病毒的药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞和病毒

犬肾(madin darbycaninekidney, MDCK)细胞系引自中国兽药监察所，按常规方法传代培养，传代次数为30代以内的对数期生长细胞备用。虎源HPAIV A/Tiger/Harbin/01/2003(H5N1)毒株，由军事兽医研究所病毒室分离、鉴定并纯化，在-70℃保存备用。

1.2 实验动物

18-20g昆明小白鼠，购于长春生物制品所实验动物中心，许可证号为SCXK 2005 0001。

1.3 试剂和仪器 新型杂多化合物(PTW)由吉林大学公共卫生学院卫生检验教研室提供；培养液(MEM)系宜兴市赛尔生物化工厂产品；新生小牛血清由大连生物试剂厂提供；胰蛋白酶为Sigma公司产品(美国)；噻唑蓝(MTT)系IGMA公司产品(美国)；CO2恒温培养箱为Heraeus BB15产品；BSL 3实验室的RVC Ⅱ型独立送风隔离笼具为苏州市冯氏实验动物设备有限公司产品；G3022型酶标仪，中国南京；Olympus双筒倒置显微镜为日本产品。

1.4 体外PTW对MDCK细胞的毒性实验

用含有20g/L(2%)FBS的MEM细胞培养液将PTW分别配制成5000、4000、2500、2000、1250、1000、625、500、312.5、250、156.25mg/L共11种剂量，于MDCK上测定最大无毒浓度(TC0)和半数中毒浓度(TC50)。将传代MDCK细胞按2×105/L接种于96孔细胞培养板0.2mL/孔形成单层细胞后倾掉培养液，加入上述11种剂量的化合物0.2mL/孔，48h后观察细胞病理效应(cytopatric effect, CPE)，同时采用MTT法测定细胞存活量并确定PTW对MDCK的TC0和TC50。

1.5 体外禽流感病毒H5N1毒力的测定

将长成单层MDCK细胞的96孔细胞培养板弃液后作为：正常对照组加入不含病毒的20g/L(2%)FCS MEM；病毒组(共7个稀释度)，分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7(即将已传代增强毒力的H5N1用20g/L(2%)FCS MEM进行连续10倍稀释)。将上述病毒液加入培养板中，100μL/孔，各组均设12个复孔，以上操作均在无菌条件下进行。将培养板放入37℃，5%(体积分数)CO2饱和湿度条件的温箱中培养，每天倒置显微镜下观察细胞的形态及变化，观察72h。与正常对照组比较。根据CPE记录病变孔数，按Reed Muench法计算致半数细胞病理改变的病毒感染剂量(TCID50)[10]。

1.6 PTW的体外抗病毒实验

实验共分4组：正常细胞对照组(NC)；病毒对照组(PC)；金刚烷胺阳性药物对照组(amantadine, AMA)，下设三种不同剂量，药物(PTW)实验组，5种剂量分别为75.00、37.50、18.75、9.38、4.69mg/L。将长成单层MDCK细胞的96孔培养板弃液后作为：①NC组，不感染病毒、不加入PTW，只加入20g/L(2%)FCS MEM；②PC组，感染病毒，不加入PTW，只加入20g/L(2%)FCS MEM；③AMA组，感染病毒，加入AMA；④PTW组，感染病毒，加入PTW。各组均设三个复孔，感染病毒的滴度均为100 TCID50，37℃，5%(体积分数)CO2饱和湿度条件的温箱中培养，连续观察。PC组CPE达“ ”时，终止培养，记录各组CPE结果，并采用MTT染色法，酶标仪570nm测定各孔吸光度值。计算PTW和AMA在不同质量浓度下抑制病毒致细胞病变的百分率，亦即PTW和AMA的抗病毒活性(抑制率)，按Reed Muench法计算PTW和AMA抑制病毒的半数抑制浓度(IC50)。计算治疗指数(TI＝TC50/IC50)。

1.7 体内病毒毒力的测定

100只小鼠随机分为10组，每组10只，将H5N1按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9和10-10稀释后，滴鼻感染小鼠，每个稀释度一组，每只35μL，于感染后的第2天开始统计死亡数，按Reed Muench法计算动物半数致死量LD50。

1.8 PTW对H5N1感染小鼠的治疗作用

将体重18-22g的昆明小鼠随机分为6组，每组12只，雌雄各半，常规喂养2-3d，健康者供实验用。①NC组：不感染病毒，以蒸馏水代替PTW；②PC组：只感染病毒，以蒸馏水代替PTW；③AMA组：按人体给药量经体重换算后设定剂量为15mg/kg；④PTW组：选择无毒剂量共3个剂量组(50.0、25.0、12.5mg/kg)。各实验组(正常对照组除外)乙醚麻醉小鼠，按0.035mL/只滴鼻感染5LD50的病毒，2h后灌胃给药，连续给药6d，观察14d，记录小鼠体重变化、死亡数及死亡时间，统计各组小鼠的平均生活日数和体重增长变化，计算各组的死亡率、存活率、死亡保护率和延长生命率。死亡和最后处死小鼠剖检取肺，计算平均肺指数。

1.9 统计方法

实验数据以±s表示，采用SPSS12.0软件包，进行单因素方差分析，P

2 结 果

2.1 PTW对MDCK细胞的毒性作用

采用细胞病变法结合MTT法检测PTW对MDCK的毒性，实验结果见表1。PTW的最大无毒质量浓度为190.55mg/L，半数致死质量浓度为909.9mg/L；PTW毒性明显低于阳性对照AMA。

2.2 PTW在MDCK中对H5N1的抑制作用

采用CPE法结合MTT法检测PTW对H5N1的抑制作用，实验结果见表2。根据吸光度(A)值，计算各剂量PTW在MDCK细胞中对流感病毒H5N1的抑制率，采用Reed Muench法计算半数抑制浓度IC50，并根据前面计算所得的各化合物的TC50值，计算治疗指数TI，结果见表3。表1 化合物对MDCK细胞的毒性（略）表2 新型杂多酸(PTW)在MDCK细胞中的抗禽流感病毒作用（略）表3 在MDCK细胞上的抗病毒活性（略）

2.3 体内H5N1毒力的测定

小鼠滴鼻感染H5N1病毒液，每只35μL，连续观察14d，记录动物死亡数。按Reed Muench法计算病毒对小鼠的半数致死剂量LD50为10-7.3。

2.4 PTW对禽流感病毒感染小鼠的治疗作用

根据小鼠死亡数和死亡时间，计算每组的平均生存日数、死亡率、存活率、死亡保护率和延长生命率，检测PTW对H5N1感染小鼠的治疗作用(表4、表5)。PTW的3个剂量组对H5N1感染小鼠均有一定的治疗作用，其中中剂量组对感染小鼠的肺炎抑制率为166.16%，生命延长率为28.36%，优于阳性对照组；平均生存日数和平均肺指数与PC有显著性差别(P

3 讨 论

高致病性禽流感是一种由H5N1病毒引发的急性传染性疾病。该病的传染性强、致死率高，对人类构成严重威胁，因而寻找高效、低毒的抗H5N1病毒的药物尤为重要。具有keggin结构的杂多化合物是一类对RNA病毒有较好抑制作用的化合物。本实验根据有机 无机杂

化的理论，采用分子自组装的方法合成结构明确的新型杂多化合物PTW。实验中分别采用体内、外实验的方法检测PTW的毒性和对H5N1的抑制作用。

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