生物技术制药1
生物制药的基本技术
生物制药是把生物体内的具有生物活性的基本物质,保持原来的结构和功能,又能在含有多种物质的液相或固相中较高纯度的分离出来。它是一项严格、细致、复杂的工艺过程,涉及物理、化学、生物学等方面的知识和操作技术。
一. 基本制造方法
1、提取法
2、发酵法
3、化学合成
4、组织培养法
5、现代生物技术
二、生化制药的六个阶段
(一). 原料的选择和预处理
(二). 原料的粉碎
(三). 提取:从原料中经溶剂分离有效成分,制成粗品的工艺过程。
(四). 纯化:粗制品经盐析、有机溶剂沉淀、吸附、层析、透析、超离心 、膜分离、结晶等步骤进行精制的工艺过程。
(五). 浓缩、干燥及保存
(六). 制剂:原料药(精制品)经精细加工制成片剂、针剂、冻干剂、粉剂等供临床应用的各种剂型。
(一)、 原料选择和预处理
A、原料选择的基本准则:
1、在大量的信息资料和实践经验的基础上,选择目标原料。
2、选择有效成分含量高的新鲜材料;
3、来源丰富易得;
4、制造工艺简单易行;
5、成本比较低;
6、原料的采集不破坏生态环境, 选择对环境友好的原材料资源,防止生物入侵。
B、预处理方法:
1、动物组织先要剔除结缔组织、脂肪组织等非活性部分;植物种子去壳除脂;微生物要进行菌体与发酵液分离等基本操作。便于贮存和运输。
2、冷冻法预处理:有些材料要冷冻保存或低温保存,以便抑制微生物和酶的作用。
3、有机溶剂除去部分水分:用丙酮或乙醇进行脱水和脱脂,有利于贮存。
(二)、原料的粉碎
原料的粉碎:在提取前先将大块的原料粉碎或绞碎成适度的粒度,或将细胞破碎,使胞内活性物质充分释放到溶液中,有利于提取或吸附。
动物脏器组织:常用绞肉机机械法粉碎;
植物肉质组织:常用磨碎法;
微生物:常用自溶、冷热交替、加砂研磨、超声、加压等 处理方法。
(三)、提 取
提取:也称抽提、萃取,就是利用一种溶剂对物质的不同溶解度,从化合物中分离出一种或几种组分的过程。分为固体处理(液—固萃取)和液体处理(液—液萃取)。 影响提取的因素:
1、被提取物质溶解度的大小:一般极性对极性;非极性对非极性;酸对碱;碱对
酸;高温;远离等电点。
2、扩散作用的影响:扩散方程式 G=DF*ΔC/ΔX*t
3、分配作用的影响:分配定律 (C1/C2)恒温、恒压=K
(四)、分离纯化
1、盐析法
利用不同的蛋白质在高浓度盐溶液中,溶解度不同程度的降低来进行分离纯化。在低盐浓度下,溶解度随着盐浓度升高而增加,称盐溶作用;当盐浓度不断升高时,不同蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出沉淀,称盐析作用。
2、有机溶剂沉淀法
利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离目的蛋白质的方法。蛋白质的沉淀与溶解,与溶剂的介电常数有关。降低溶液的介电常数,使其溶解度变小,同时,还破坏蛋白质的水化膜而使蛋白质沉淀析出。
3、等电点沉淀法
利用蛋白质在等电点时的溶解度最低,而各种蛋白质又具有不同的等电点的特性进行分离的工艺过程。
由于各种蛋白质在等电点时,仍有一定的溶解度而沉淀不完全,多数蛋白质的等电点又都十分接近,所以单独使用效果不理想,分辨力差,多用于提取后除杂蛋白。实际生产中常与有机溶剂沉淀法、盐析法联合使用。
4、膜分离法
膜分离技术包括超滤、反渗透析、电渗析、微孔过滤、气体渗析和超精密过滤。
5、离子交换层析
采用不溶性高分子化合物作为离子交换剂,分离纯化各种生化物质。
6、凝胶层析
指化合物随流动相流经装有凝胶的固定相的层析柱时,因其各种物质分子大小不同而被分离的技术。又称凝胶过滤、凝胶渗透过滤、分子筛过滤、阻滞扩散层析、排阻层析。
7、亲和层析
生物活性物质都有亲和作用,如酶与底物、激素与受体、核酸的互补链间,多糖与蛋白质复合体。亲和层析是利用生物大分子的特异亲和力而设计的层析技术。可逆结合的特异性物质称为配基,与配基结合的层析介质称为载体。亲和层析能从粗提液中,通过一次简便处理,便可得到高纯度的活性物质,既可分离一些生物材料中含量极微的物质,又能分离一些性质十分相似的物质。
(五)、 浓缩
浓缩:低浓度溶液通过除去溶剂变为高浓度溶液的过程。常在提取后和结晶前进行,有时也贯穿与整个制药过程。
蒸发装置的设计原理:加热、扩大液体表面积、低压。
(六)、 结晶
结晶:利用某些药物具有形成晶体的性质使目标药物(溶质)呈晶态从溶液中析出的过程。
结晶的条件:
1、纯度:各种物质在溶液中均需达到一定的纯度才能析出结晶。蛋白质和酶,纯度不低于50%。总趋势是越纯越易结晶,但已结晶的制品不表示达到了绝对的纯化,只能说到了相当纯的程度。有时纯度不高,但加入有机溶剂和制成盐,也能达到结晶。
2、浓度:结晶液的浓度要较高,以利于分子间的碰撞聚合。但浓度过高,相应杂质和
溶液黏度增大,反而不利于结晶,或生成纯度较差的粉末结晶。
3、pH:选择pH在pI附近,有利于晶体析出。
4、温度:通常在低温条件进行,活性物质不易变性,又可避免细菌繁殖。
5、时间:结晶的生成和生长需要时间。但生物药物要求在几小时内完成,时间不宜过长。
6、晶种:不易结晶的药物常加晶种。
(七)、干燥
干燥:是从湿的固体生物药物中,除去水分或溶剂而获得相对或绝对干燥制品的工艺过程。它也是一种蒸发,但不同于浓缩。通常包括原料药的干燥和制成的临床制剂的干燥。
1、常压干燥:通风与加热结合。成本低干燥量大。但时间长,易污染。
2、减压干燥:利用专用设备加速减压,使溶剂迅速蒸发。时间短,温度低。制药常用方法。
3、喷雾干燥:将液体通过喷射装置喷成雾滴后,在一定流速的热气流中,迅速蒸发干燥的方法。
4、冷冻干燥:在低温( -60-10 ℃ )及高真空6.67-40Pa(0.05-0.3mmHg)下,将物料与溶液中的水分直接升华的干燥方法。
(八)、灭菌
灭菌:指杀灭或除去一切微生物的操作技术。
1、干热空气灭菌:通常在烘箱里利用热空气杀灭微生物,在100 ℃,1h可杀死繁殖的细菌。但某些细菌在一定情况下可以变成芽孢,有较强的耐热力,一般需160-170 ℃ 灭菌1h以上或140 ℃灭菌3h以上。灭菌的时间应自全部进行灭菌的物品达到灭菌温度时算起。待灭菌物品的温度常落后于烘箱室的温度,特别是导热性能差或装量大的待灭菌物品。要确保灭菌完全,应测定温度延后时间,将延后的时间考虑到规定的灭菌时间内。
2、湿热灭菌:
常压灭菌,即在常压下用100 ℃流通蒸汽或在水内煮沸来杀灭细菌。
减压灭菌:在热压灭菌器中,用超过101--.325kPa的饱和蒸汽杀灭细菌。
3、紫外线灭菌:主要用于空气和物体的表面灭菌。一般紫外灯高度距操作台面不超过
1.5m,被灭菌物距灯与台面的垂直点中心不超过1.5 m。用于室内空气灭菌时,约6-15m3的空间装一盏紫外灯。
人体若照射紫外线过久会产生眼结膜炎、红斑和皮肤变红等。故一般均在操作前照射1-2h。若操作时必须照射时,对操作人员的眼睛和皮肤要加以防护。
4、过滤灭菌:通过适宜的滤器除去药液中所含的细菌。常用有硅藻土滤柱、素瓷滤柱、垂熔玻璃滤器、石棉板吕器和微孔滤膜(纤维素酯膜、聚碳酸酯膜)。滤器孔径约为0.2μm时,灭菌结果才可靠。
5、化学灭菌:用化学药品抑制或杀灭细菌的方法。常用其气体或蒸汽杀灭细菌的药品有甲醛、丙二醇、乳酸等,适用于无菌室的空气灭菌。
三、生物制药需要经常注意的几个问题:
1、生物材料的组成成分复杂,各种化合物的形状、大小、相对分子质量和理化性质都各不相同,有些还属于未知。且这些化合物在分离时仍在不断的代谢之中。
2、有些化合物含量很低或极微。制备时,原材料用量很大,得到产品很少。
3、生物活性物质,一旦离开了生物体内环境,很易变性。
4、分离制备的过程几乎在溶液中进行,各种温度、PH、离子强度等参数,对溶液中各种组成的综合影响,常常无法固定,有些实验或工艺设计的合理性不强,常带有很大的
经验成分。因此,要建立重复性好的成熟工艺,对生物材料、各种试剂及其辅料都要加以严格规定。
5、生物药物“均一性”证明与化学药物的“纯度”是不同的。