魔王谷稻瘟病抗性的遗传分析和基因定位
魔王谷稻瘟病抗性的遗传分析和基因定位 作者:殷得所 李进波 夏明元 等
来源:《湖北农业科学》2014年第22期
摘要:采用田间自然诱发鉴定法,对持久抗病品种魔王谷和感病品种鄂晚8号的DH系和F2∶3家系进行了抗性遗传分析和基因初步定位,并使用NBS-LRR同源序列引物进行了抗性基因的筛选,揭示魔王谷的抗病机理。结果表明,两个群体的穗瘟田间抗性由第12染色体RM512标记下游的一对隐性主效基因控制,并在Chr11的RM224下游、Chr7的RM248下游等染色体区间存在多个QTLs。NBS-LRR基因序列的筛查也表明在Chr12、Chr8、Chr6、Chr11对应区间的基因与抗性相关度较高。
关键词:稻瘟病;持久抗性;基因定位;NBS-LRR同源序列
中图分类号:Q37;Q341 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2014)22-5346-05
由子囊菌引发的水稻稻瘟病是水稻生产中最严重的病害。据统计,全球每年由稻瘟病造成的稻米产量损失足以养活6 000万人以上,我国稻瘟病年发病面积约3.8×106 hm2,发病面积占水稻种植面积的6%,年损失稻谷约1×109 kg,稻瘟病已成为水稻高产稳产的严重障碍[1,2]。稻瘟病的防治主要采用化学防治和抗病新品种培育两种途径,化学防治成本高、效果差且污染环境,选育和推广抗病水稻品种被认为是控制稻瘟病害最安全、经济和环保的方法。 截至2013年8月,至少报道了68个抗稻瘟病位点的83个主效抗性基因[3]。报道和鉴定了较多持久抗瘟性水稻品种,如Moroberekan、Tetep、OS6、Dourode Perecose、IR36、IR42、IR64以及小粒野生稻、密阳30、湘资3150、天津野生稻、魔王谷、谷梅2号等[4-7]。品种范围涉及古老的地方品种、栽培稻品种和野生稻。这些抗源品种在稻瘟病的抗病育种中发挥着重要作用。由于稻瘟病菌容易出现新的生理小种,使得小种专化抗性丧失,多数抗病品种在推广种植3~5年后会出现感病,逐渐丧失抗病性[8,9]。因此,延长水稻品种的稻瘟病抗性周期成为当前水稻抗性育种的主要任务,而开展广谱、持久抗性的水稻育种是解决稻瘟病危害最有效且最环保的途径。
魔王谷的持久稻瘟病抗性前人已有报道,本研究采用田间自然发病的方式,鉴定家系材料的抗病表型,通过构建抗病品种魔王谷与感病品种鄂晚8号的DH系和F2∶3群体,分析魔王谷的抗性遗传。SSR标记群分法与NBS-LRR同源基因比较结合,对抗病基因所在区间进行了初步定位。本研究旨在探求广谱、持久抗病的遗传基础,为抗病基因的精细定位和克隆以及育种利用提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
魔王谷为云南稻区的地方品种,高抗稻瘟病,本试验中作为抗源;鄂晚8号为湖北省农业科学院育成的优质晚粳品种,高感稻瘟病;9311为江苏里下河地区农业科学研究所育成的优质中籼品种,高感稻瘟病。
1.2 群体构建
2007年以魔王谷为父本,与鄂晚8号配制杂交组合, F1代植株取花药进行花药培养, 得到加倍单倍体(DH系)植株113株, 海南移栽并收获单株种子。
按照单粒传原则,收获“鄂晚8号/魔王谷”组合 F1单株种子,于海南种成F2群体,分单株收获种子,得到F2∶3家系。2008年春将DH系和F2∶3家系两个群体在恩施两河病圃栽种。 2009年夏在武汉以魔王谷为父本,与9311配制F1杂交组合,再以9311为轮回亲本,通过2次回交和自交,构建BC2F3回交渗入系。2012年将263个BC2F3家系在宜昌远安病圃种植。
1.3 田间抗性鉴定和遗传分析
种子4月初播种,5月初移栽大田,每份家系材料栽插20苗,水肥管理同当地水平,防虫不防病。分蘖期调查叶瘟的发病率、病级,抽穗后调查穗瘟损失率、穗瘟病级、发病率等指标。按照叶瘟病级分为1-9级,穗瘟病级按0、1、3、5、7、9级进行统计。将发病数据制成次数分布表,进行遗传推断。
1.4 叶片DNA提取
选取水稻植株叶片组织,采用CTAB法提取水稻基因组DNA。
1.5 引物筛选、设计与合成
采用水稻12条染色体上460对SSR引物进行抗、感亲本间差异标记的筛选,获得的差异标记进行连锁标记分析。抗病同源基因引物序列参考Shang等[10]发表的36对Psudogene引物进行序列设计。所有引物由上海生物工程公司合成。
1.6 基因定位
基因分型以魔王谷作为抗病对照,鄂晚8号作为感病对照。采用群分法(Bulked segregant analysis, BSA),用SSR引物进行主效抗性基因的初步筛选,选取DH家系中高抗(穗瘟抗级为0级)和高感(穗瘟抗级为9级)的家系各9个,分别组成抗、感小群体。利用在魔王谷与鄂晚8号间的多态性SSR引物进行连锁标记筛选。
利用从9311和日本晴全基因组序列注释得到的NBS-LRR同源序列,选取在籼稻基因组中有功能而在粳稻基因组中功能缺失的36个NBS-LRR基因,作为感病共分离标记,进行候选基因分析。
按照引物的相关指标进行SSR引物和Psudogene基因引物的PCR扩增,酶切按照酶的使用说明进行。产物用2%的琼脂糖凝胶和6%的聚丙烯酰胺凝胶分离,EB和银染色后照相,统计带型。
2 结果与分析
2.1 田间抗性鉴定与遗传分析
两个组合共3个群体,于2008和2012年分别在恩施和宜昌两地的病圃进行了抗性鉴定。“鄂晚8号/魔王谷”组合的F2∶3家系群体共239个,在恩施病圃进行鉴定。叶瘟发病表现为正态分布,穗瘟发病则在0级(高抗)和7级(高感)处各有一个高峰,表现为双峰分布(图
1),抗感比例为64∶161,经卡方验证符合1∶3(X2=1.245
DH家系共107个,叶瘟发病表现为正态分布,穗瘟发病分布图在7级处为分界点(图
2),按1对隐性基因推断假设进行卡方验证,抗感比例为44:63,X2=3.03
在宜昌病圃进行鉴定的“9311/魔王谷”组合后代BC2F3家系,叶瘟发病仍然表现为正态分布,穗瘟发病则表现为偏态分布,且抗性家系明显偏少(图3),结合前2个群体的发病分布推断,其穗瘟主效抗性基因为隐性控制模式。
2.2 多态性标记筛选和基因定位
采用群分法(BSA),用84对多态性SSR引物对DH家系的抗感小群体进行连锁标记筛查,发现在第11染色体的RM224和第12染色体的RM512两个片段区间的感病基因型和表型符合度高。用这两个区间的引物对所有的感病DH家系进行验证(图4,图5),发现在51个感病家系中,RM224区间有16个重组体,RM512区间有6个重组体,RM512位点可以解释88%的感病表型,因此,将隐性抗病基因初步定位在第12染色体的RM512区段下游,距离为11.7 cM。
2.3 抗病基因同源序列分析
36对Psudogene引物先进行抗病和感病亲本间的差异筛查,所有引物均能扩增出目标产物,但经过相应的内切酶酶解后,只有Psu12、Psu18、Psu19、Psu21、Psu26、Psu28、Psu35、Psu36这8对引物分别在9311与日本晴和魔王谷与鄂晚8号间有差异(图6)。用这些引物对全体DH家系进行基因分型,统计基因型与表型的符合度(表2),结果显示,位于12号染色体的Psu36抗病同源序列标记符合度最高(图7),这与SSR分型定位的染色体相同。
3 小结与讨论
3.1 关于田间自然诱发与抗病表型鉴定
梁斌等[11]用云南省菌株96-5-1a对魔王谷与丽江新团黑谷的F2和BC1F1群体的人工接种鉴定认为,魔王谷抗性由1对显性基因控制。Sun等[12]用魔王谷与CO39的F2和F8群体进行了遗传分析,采用318-2菌株进行人工接种和大田诱发鉴定,表明魔王谷抗性由1对显性基因控制。本研究根据3个群体的田间发病表现分析得出,魔王谷抗性主效基因为隐性基因,与前人研究结论差异较大,是否与鉴定菌系有关尚不能确定。本研究曾将相同的DH家系同时在恩施和宜昌病圃进行大田自然诱发鉴定,抗感表型差异很大(实验室数据,未发表),本试验对宜昌种植的“9311/魔王谷”的BC2F3群体进行了田间抗性鉴定,结果显示与恩施病圃的发病分布不同。说明恩施和宜昌两地的菌株致病能力和毒性可能存在差异,从而导致群体的抗感表现不同。
1998年,Pan等[13]报道了一份来自云南当地的高抗稻瘟病品种“Maowanggu”,其抗性由位于第2和第6染色体的2对显性基因控制,但对此地方品种的具体来源编号不清楚,无法与本研究中的魔王谷进行比较。
3.2 关于基因定位群体
本研究使用了“鄂晚8号/魔王谷”这个组合的两个群体的DH家系和F2∶3家系进行表型鉴定和遗传分析,但主要采用DH家系作为基因定位群体,虽然F2∶3家系数量较多,定位群体较大,有利于精确定位,但DH家系内遗传背景一致,有利于提高抗性鉴定和标记分析的准确度。另外,本研究使用感病群体作为定位群体,主要为了避免大田诱发致病环境中由于熟期等因素导致抗病株的假阳性。
3.3 NBS-LRR抗病同源序列与抗性的关系
水稻籼、粳两个亚种完成全基因组测序后,抗病基因的保守序列研究有了很大进展。Shang等[10]根据籼、粳两亚种对稻瘟病抗性的不同机理,比较了9311和日本晴全基因组内NBS-LRR序列的分化,发现在两份品种的基因组内均存在很多因提前终止或移码突变导致成为假基因的读码框,并且两个基因组间假基因的组成和分布也存在很大差异,推测一个NBS-LRR功能基因在籼稻中若为抗病基因,则其粳稻中对应的假基因即为感病基因,这个假基因就可以当做感病表型的共分离标记进行群体分析。用这个策略鉴定了籼稻品种、地谷中的Pid3抗稻瘟病基因。本研究借鉴此策略鉴定魔王谷的抗病基因。
3.4 基因定位与克隆
Sun等[12]将魔王谷的显性抗病基因Pi49定位在第11染色体的两个SSR标记K10和K134间,遗传距离分别为1.01和1.89 cM,并检测到9个QTLs分布在第2、3、6、8、9、12染色体上。本研究也在第11染色体的RM224下游检测到了贡献率较大的抗病位点,可能与Pi49
区间相同。本研究采用图位克隆和NBS-LRR同源基因鉴定法,对魔王谷的抗病相关基因进行了初步定位。群分法(BSA)的结果显示,魔王谷的田间抗性除了主效基因外,可能还有其他微效基因参与控制,SSR标记分析和NBS-LRR基因筛选也说明在第6、8、11染色体上存在与家系表型相关度较高的标记位点。本研究获得的连锁标记离目标基因尚有一定距离,以假基因作为共分离标记的试验尚未观察到与感病表型完全共分离的现象,RM512下游11.7cM的物理位置,大约在8614 402 bp处,与P36的物理位点(18342 097)距离也较远。推测其原因,除了定位群体对于研究由多基因控制的抗性而言偏小外,还可能是由于感病家系未发病,导致表型鉴定存在误差;其次,多基因控制的抗性体现出一定的复杂性,例如,有些家系丢失了主效抗性基因,但由于微效基因的聚合而同样产生了抗性,导致表型鉴定的误差。因此,主效基因的精细定位乃至克隆还要依赖于定位群体的扩大和染色体区间标记的加密来进行深入研究,或者通过回交和标记选择将主效基因从复杂的多基因背景中剥离出来。另外,分离到病圃中的主要致病菌进行单孢菌系人工接种,可以得到重复性更好的表型鉴定,也可能是可行的方法。 参考文献:
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(责任编辑 韩 雪)