生物化学实验基本操作-实验报告
生物化学实验基本操作
一、实验目的
1、熟悉化学类实验室的基本常识、规则、安全及防护知识。
2、掌握基本实验操作及常用仪器的使用方法。
3、通过实际操作，进一步掌握理论知识，能独立完成真个实验的设计、操作及计算。
二、实验仪器与试剂
1、实验器材
仪器名称 型号 厂家
Sartorius PB-10 PH 计
干燥箱 101EXB-3型电热鼓风干燥箱 上海树立仪器仪表有限公司 酶标仪 DNM-9602酶标分析仪 北京普朗新技术有限公司
2、实验试剂
试剂名称 生产厂家 生产批号 质量（g ） Na 2HPO 4 20100701 7.16 北京化工厂
NaH 2PO 4 3.12 北京益利精细化学品有限公司 20110313
NaCl 850328 天津市塘沽化学试剂厂 0.9
001107 BCA 蛋白定量试剂盒 北京普利莱基因技术有限公
三、实验内容
（一）蛋白质的定量测定
1、实验原理
Bicinchoninic acid (BCA)法是近来广为应用的蛋白质测定方法。即在碱性环境下，蛋白质与Cu 2+络合并将Cu 2+还原成Cu 1+。BCA 与Cu 1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nm 处有高的光吸收值，并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。
2、实验方法
（1）、工作溶液（Working Reagent,WR）的配制：
将50体积BCA Reagent 与1体积Cu Reagent 混合即为WR 工作试剂，呈嫩绿色。
（2）、标准蛋白溶液配制：
用双蒸水与待测蛋白样品匹配之缓冲液进行倍比稀释：40μl 4000μg/ml BSA+60μl 稀释溶液（H 2O ）=100μl （BSA=1600μg/ml）, 从中取出50μl 连续倍比稀释，得到BSA 标准溶液1600、800、400、200、100、50、25μg/ml,各50μl 。
（3）、蛋白测定
蛋白质浓度线性检测范围为10-2000μg/ml。微板测定用96孔板，反应终体积225μl ，用酶标仪测定。
a. 微板测定：用加样器将25μl 标准品与200μl WR工作液混合于微板孔中。 b. 37℃恒温反应30min 。
c. 将反应管温度冷却至室温，测定562nm （实际测定波长为570nm ）光密度（OD ）值。
d. 绘制标准曲线。X 轴为BSA 标准蛋白浓度（μg/ml）, 轴为各标准管对应的OD 值。绘制excel 拟合曲线。
3、实验结果
（1）、微板测定方案实验数据
标号 蛋白浓度标准蛋白体积WR 工作试剂OD 值OD 值
（μg/ml） （μl ） （μl ） （1） （2） 1 0 25 200 0 0 2 25 25 200 0 0 3 50 25 200 0 0 4 100 25 200 0.032 0 5 200 25 200 0.135 0.098 6 400 25 200 0.289 0.309 7 800 25 200 0.644 0.704 8 1600 25 200 1.310 1.354
（2）、
根据两次测得的吸光度值分别绘制拟合曲线，分别为蛋白浓度
–吸光度（1）和蛋白浓度 –吸光度（2）。
4、结果讨论
（二）PBS 缓冲液的配制
1、0.2M Na2HPO 4 ：称取7.16g Na2HPO 4-12H 2O ，溶于100ml 水。 0.2M NaH2PO 4 ：称取3.12g NaH2PO 4-H 2O ，溶于100ml 水。
2、各种浓度PB （pH=7.4）:
先配0.2M PB（pH=7.4,100ml）:取19ml 0.2mol/L的NaH 2PO 4，81ml 0.2mol/L的Na 2HPO 4，测得溶液pH 低于7.4，滴NaOH 至pH 计测得pH=7.4即可。 然后，只需将0.2M PB（pH=7.4）按相应比例适当稀释即可，如： 0.1M PB（pH=7.4）：取50ml 0.2M PB,加水稀释至100ml 即可。 0.01M PB（pH=7.4）：取5ml 0.2M PB,加水稀释至100ml 即可。 0.02M PB（pH=7.4）：取10ml 0.2M PB,加水稀释至100ml 即可。
3、加入NaCl 至0.9%（g/100ml）即可。