叶绿素合成关键酶基因表达的半定量RT-PCR分析

基因组学与应用生物学，2015年，第34卷，第3期，第593-598页Genomics and Applied Biology, 2015, Vol.34, No.3, 593-598

研究报告

Research Report

叶绿素合成关键酶基因表达的半定量RT-PCR 分析

姚嘉龙郭蓓

谢皓*

北京农学院植物科学技术学院/北京农业应用新技术北京市重点实验室, 北京, 102206*通讯作者, [email protected]

摘要为了解叶绿素合成关键酶基因在大豆不同生育期的表达情况，本研究以拟南芥叶绿素合成关键酶基因序列设计引物，大豆科丰14和它的持绿突变体BN108为试材，利用半定量RT-PCR 分析了9种叶绿素合成关键酶基因在开花期和成熟前期表达量的变化。结果表明，HEM A 、GSA 、HEM E 、POR 、CHLG 基因在成熟前期表达量显著下降(p

关键词大豆, 叶绿素, 关键酶基因, 表达, 半定量PT-PCR

Expression Analysis of Key Enzyme Gene Involved in Chlorophyll Biosynthesis by Semi-quantitative RT-PCR

Yao Jialong Guo Bei

jing, 102206

*Correspondin g author, [email protected]:10.13417/j.gab.034.000593

Xie Hao *

College of Plant Science and Technology, Beijing University of Agriculture/KeyL aboratory of New Technology in Agricultu ral Ap p lication , Bei-

Abstr act The objective of this study was to dissect the expression variation of key enzyme gene involved in chlorophyll biosynthesis at different development stages of soybean. Primers were designed according to the key enzyme gene sequence of chlorophyll biosynthesis in Arabidopsis, semi-quantitative RT-PCR was employ ed to analyze expression variations of key enzyme gene in chlorophyll biosynthesis at flowering and early maturity stages for KF14and its stay-green mutant BN108in soybean. The results showed that gene expression levels of HEM A, GSA, HEM E, POR and CHLG in KF14, especially for HEM A and GSA had significant decline (p

K eywor ds Soybean, Chlorophyll, Key enzyme gene, Expression, Semi-quantitative RT-PCR 叶绿素(chlorophyll,Chl) 是绿色植物叶绿体内参与光合作用的重要色素，它的含量与植物的光合速率相关。叶绿素的生物合成是一个复杂、多种酶参与整个过程需要15步反应，涉及到参与合成的15种酶

基金项目：本研究由国家自然科学基金(31371648) 资助

类(Beale,2005) 。具体而言，叶绿素的生物合成过程

包括二个部分(王平荣等, 2009) ，第一部分是L-谷氨酰-tRNA →谷氨酸酰酯-1-半醛寅滓-氨基酮戊卟啉原芋寅原卟啉原御寅原卟啉御，参与反应的酶

的过程，通过对衣藻、拟南芥和水稻等植物的研究，酸→胆色素原→羟甲基胆色素原寅尿卟啉原芋寅粪

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基因组学与应用生物学Genomics and Applied Biology

分别是谷氨酰-tRNA 还原酶、谷氨酸酯-1-半醛2,1

关键因素之一，本试验以茁-tublin 为内参基因，在

氨基变位酶、5-氨基酮戊酸脱水酶、胆色素原脱氨酶、22~28个循环数内来探索内参基因和叶绿素酶基因尿卟啉原芋合成酶、尿卟啉原芋脱羧酶、粪卟啉原芋氧化酶和原卟啉原氧化酶等8种酶，对应的编码基因分别是HEM A 、G SA 、HEM B 、HEM C 、HEM D 、HEM E 、HEMF 和HEM G 。第二部分是原卟啉御寅Mg-原卟啉御寅Mg-原卟啉Ⅸ甲酯寅联乙烯原叶绿素酸酯寅原叶绿素酸酯寅叶绿素酸酯寅叶绿素a ，依次需要Mg-螯合酶、Mg-原卟啉Ⅸ甲基转移酶、Mg-原卟啉御单甲基酯环化酶、二乙烯基还原酶、原叶绿素酸酯氧化还原酶、叶绿素合酶和叶绿素酸脂琢氧化酶等7种酶催化反应，编码这些酶的基因分别是CHLD (CHLH , CHL1, CHL2) 、CHLM 、CRD 1、DVR 、POR 、CHL G 和CAO

(Beale,2005; Nagata et al., 2005) 。

叶绿素生物合成的调控亦是一个复杂的系统，除受外部环境条件之外，如光照(Armstronget al., 1995) 、温度(Nagataet al., 2005) 和营养元素(Tanakaet al., 2007) 等，其内在相关基因调控也很重要。崔世友和喻德跃(2007)、李广军等(2010)通过分析大豆不同发育时期叶绿素含量QTL ，发现有些基因的表达在几个生育时期都进行的，但是多数基因是分阶段、动态表达的。而且，植物体内叶绿素的新陈代谢在不断进行，叶绿素的合成与降解同时发生，意味着叶绿素的积累是个动态的过程。因此，叶绿素的生物合成有一个复杂的调控机制，涉及基因的功能和作用机理尚未完全清晰，值得进一步研究。本文以大豆品种科丰14(KF14)和其持绿突变体BN108为试验材料，利用半定量RT-PCR 法分析开花期和成熟前期叶片叶绿素合成关键酶基因的表达情况，试图通过在生殖前期和生殖后期叶绿素合成酶基因的表达变化，推

测叶绿素生物合成过程中酶基因的调控方式，为揭示叶绿素生物合成机理提供参考。

1结果与分析

1.1样品RNA 的质量

取大豆样品1滋L 总RNA ，1%琼脂糖凝胶电泳后，28S RNA 和18S RNA 条带清晰，完整性较好，无明显降解(图1) 。紫外分光光度计测得所提RNA 的OD 260/280值约为2.0，表明总RNA 提取质量较好，符合进一步RT-PCR 的要求。1.2RT -PC R 最佳循环数

确定适宜的循环次数是保证实验结果准确性的

的指数期，根据PCR 电泳扩增结果图(图2) ，确定了内参茁-tublin 基因在26个循环时达到指数期，参试的9个叶绿素酶基因HEM A1、CAO 、CHL M 、GSA2、HEM B1、CHLH 、CHL G 、HEME1、PORB 对应的指数期分别为24、26、25、25、26、25、27、27和25个循环，分别以上述循环数进行RT-PCR 扩增。1.3叶绿素合成关键酶基因表达量的比较

供试材料KF14和BN108属于野生型和突变体关系。BN108来源于KF14辐照后代的持绿突变(白红丹等, 2013) ，成熟时叶片(包括种皮和子叶) 绿色不褪。提取上述材料在开花期和成熟前期叶片的总

RNA ，

利用半定量RT-PCR 分析了15种叶绿素合成酶基因的表达，但只有9种基因被检测到，分别为谷氨酰-tRNA 还原酶(HEMA) 、谷氨酸酯-1-半醛2,1氨基变位酶(GSA)、5-氨基酮戊酸脱水酶(HEMB) 、尿卟啉原芋脱羧酶(HEM E ) 、Mg-螯合酶(CHLH ) 、Mg-原卟啉御甲基转移酶(CHLM) 、原叶绿素酸酯氧化还原酶(POR)、叶绿素合酶(CHLG)和叶绿素酸脂琢氧化酶(CAO ) 等基因。图3是以茁-tublin 基因为内参调整的体系扩增叶绿素酶基因的RT-PCR 电泳图，图4为利用Quantity one 图像分析软件

分析各基因

图1大豆叶片总RNA 的琼脂糖凝胶电泳图注:M :DL2000Marker; 1~3:BN108; 4:KF14

Figure 1Total RNA of soybean leaf isolated fr om agarose gel ele ctrophore sis

Note:M:DL2000Marke r; 1~3:BN108; 4:KF14

图2不同基因循环数的P CR 扩增电泳图

注:M :1kb DNA La dder M arker; 22~28:7个不同的循环次数F igure 2PC R ampli f ication under di f f erent ge nes c y cle numbers N ote:M :1kb DN A L adder M arke r ; 22~28:S even di f f erent c y cles