脂肪干细胞在体外特定培养液中向软骨细胞表型的分化
中国组织工程研究与临床康复第11卷第10期2007-03-11出版
JournalofClinicalRehabilitativeTissueEngineeringResearchMarch11,2007Vol.11,No.10
CRTER
基础医学
脂肪干细胞在体外特定培养液中向软骨细胞表型的分化*☆
徐
亮,杨述华,田宏涛
Chondrogenesisofadipose-derivedstromalcellsinvitro
Abstract
AIM:Toinvestigatethefeasibilityofratadipose-derivedstromalcells(ADSCs)astheseedcelloftissueengineeredcartilageafterinvitrodifferentiationintochondrogenicphenotypewithinductionoftransforminggrowthfactor-beta(TGF-β).
METHODS:TheexperimentwasaccomplishedintheLaboratoryofPubicHealth,TongjiMedicalCollegeofHuazhongUniversityofScienceandTechnologybetweenApril2005andJune2006.①ADSCsisolatedfromratinguinalfatpadsweredigestedwithcollagenase,culturedandpassagedinvitro.②TheculturedADSCsatthe3rdpassagewereinduced
todifferentiateintochondrocytesininductionmediumcontainingTGF-β
,desamethasonandvitaminC.③Fourteendayslater,matrixofcartilagecellswasdetectedbyalcianbluestaining,andcartilagespecificcollagenⅡwasdetectedbyimmunohistochemistry.TheexpressionofSox9,proteoglycanandcollagenⅡintheinducedADSCswerealsodetectedbyWestern-blotandreversetranscription-polymerasechainreaction(RT-PCR).
RESULTS:①Attheinitialdaysofinoculation,thecellswereround;oneweeklater,theattachedcellsincreasedtothelongfusiform;14dayslater,theattachedcellswereidenticalwithbonemarrowmesenchymalcellsinmorphology,andcoveredwiththewholemonolayer,withthecentralcellsarrangedtightly.TheinducedADSCstransformedtopolygonandpresentedflatafter14-dayinduction,includingspindle-shapedorpolygonal-shaped.②HistologicalstainingofproteoglycanwithalcianbluestainingforcartilagespecificcollagenⅡrevealeddepositionoftypicalcartilageextracellularmatrix.③ImmunohistochemicalstainingshowedthepositiveexpressionofcollagenⅡ.④RT-PCRgeneexpressionanalysisofcharacteristicchondrogenicrelatedgenes,suchasSox9,proteoglycanaswellascollagenⅡwerepositive.⑤Western-blotdetectionconfirmedpositivecollagenⅡexpressionby14daysinduction.
CONCLUSION:ADSCscandifferentiatetobechongrogenicphenotypewhenculturedinadefinedmedium,andsecretethespecificmatrixofchondrocytes.ADSCscanlikelytobeservedasoptimalautogenouscellsourceforcartilagetissueengineering.
XuL,YangSH,TianHT.Chondrogenesisofadipose-derivedstromalcellsinvitro.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiuyuLinchuangKangfu2007;11(10):1805-1807(China)[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/07-10/10k-1805(ps).pdf]
摘要
目的:应用转化生长因子β1,体外诱导脂肪干细胞向成软骨细胞表型分化,探讨其作为组织工程化软骨种子细胞的可行性。方法:实验于2005-04/2006-06在华中科技大学同济医学院公卫实验室完成。①取大鼠腹股沟处脂肪,酶消化法分离、培养脂
肪干细胞,体外传代培养。②取第3代细胞通过转化生长因子β1、地塞米松和维生素C诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化。③诱
导后14d观察细胞形态变化,进行阿辛蓝染色检测软骨基质的分泌、免疫组织化学检测细胞Ⅱ型胶原的表达,采用Western-blot和反转录-聚合酶链反应检测诱导前后成软骨相关的Sox9,蛋白聚糖与Ⅱ型胶原的表达。
结果:①细胞接种的最初几日,细胞呈圆形,1周后贴壁细胞呈长梭形,体积增大;14d后贴壁生长细胞基本长满单层,中心细胞排列紧密,形态与骨髓间充质干细胞相似。诱导培养后,细胞形态逐渐由梭型向多角形、多边形转变。诱导14d后多数细胞呈平坦的多边角形状细胞;其夹杂多角突起状或多角纺锤状细胞。②诱导后阿辛蓝染色示糖胺聚糖均匀分布于基质中。③免疫组织化学染色示基质中Ⅱ型胶原表达阳性。④反转录-聚合酶链反应检测成软骨相关的Sox9、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原mRNA表达阳性。⑤Western-blot印迹检测细胞诱导后Ⅱ型胶原蛋白表达阳性。
结论:脂肪干细胞在特定培养液的诱导下可向成软骨细胞表型分化,并能分泌软骨细胞特异性基质,有望成为软骨组织工程新的细胞来源。
关键词:干细胞;转化生长因子;软骨细胞;细胞分化;脂肪组织/细胞学
徐亮,杨述华,田宏涛.脂肪干细胞在体外特定培养液中向软骨细胞表型的分化[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,11(10):1805-1807
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/07-10/10k-1805(ps).pdf]
和胎盘组织中成功分离出间充质干细胞与骨
0引言
髓来源的干细胞相比[5,6],这些细胞易分离,间充质干细胞含量较高[7]。目前国外有研究显示构建组织工程化软骨必须获得大量有功能
脂肪组织中含有大量具有多向分化潜能的干和活力的软骨细胞。但软骨细胞来源有限,体外细胞,脂肪来源干细胞具有比骨髓间质干细胞大量扩增后容易出现老化和去分化现象[1-3]。组更多的优点,成为种子细胞的热选之一
[8-10]
。
织工程种子细胞的研究最早也最广泛的是骨髓来源的间充质干细胞,但骨髓中的间充质干1材料和方法
细胞数量很少(约占细胞总数的1/105
),且存在取材困难等问题[4]
。目前已经从脂肪,脐带
设计:单一样本观察。
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DepartmentofOrthopaedics,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,HubeiProvince,ChinaXuLiang☆,Studyingfordoctorate,
Physician,DepartmentofOrthopaedics,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,HubeiProvince,Chinaxuliang_777@sina.com
Supportedby:theNationalNaturalScienceFoundationofChina,No.30471753*Received:2006-10-14Accepted:2007-01-22
华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科,湖北省武汉市430030徐亮☆,男,1973年生,辽宁省沈阳市人,汉族,华中科技大学同济医学院在读博士,医师,主要从事关节损伤与修复研究。xuliang_777@sina.com
国家自然科学基金
项目(30471753)*
中图分类号:R394.2文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2007)10-01805-03
收稿日期:2006-10-14修回日期:2007-01-22(06-50-10-7463/W・Y)
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CRTER
徐亮,等.脂肪干细胞在体外特定培养液中向软骨细胞表型的分化
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课题背景:软骨组织因无血管、神经和淋巴引流,仅靠关节腔内滑液获取营养,代谢以无氧酵解为主的生理学特点,决定了它极其有限的再生能力。目前国内外研究显示脂肪组织中含有大量具有多向分化潜能的干细胞,脂肪来源干细胞具有比骨髓间质干细胞更多的优点,有望成为软骨组织种子细胞的热选之一。
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单位:华中科技大学同济医学院附属协和积分数为0.03的过氧化氢孵育5~10min,以
医院骨科。
Ⅱ型胶原多克隆抗体进行常规SP法免疫组
材料:实验于2005-04/2006-06在华中织化学,二氨基联苯胺室温下避光显色,梯度科技大学同济医学院公卫实验室完成。6~8周乙醇依次脱水,中性树胶封固。
龄Wistar大24只,雌雄不拘(华中科技大学反转录-聚合酶链反应检测:分别收集对同济医学院实验动物中心提供,许可证号:
照组与实验组细胞,检测Sox9、蛋白聚糖、ⅡSYXK(鄂)2004-0028)。DMEM-F12(Gibco),型胶原mRNA表达。将脂肪干细胞诱导培养
胎牛血清(Gibco),Ⅰ型胶原酶,转化生长因子14d后,按试剂盒的说明书分别提取实验组与
β1,地塞米松,维生素C(Sigma公司),Ⅱ型胶
对照组细胞的总RNA。按设计的扩增前基因原多克隆抗体、免疫组织化学试剂盒(北京中引物进行反转录-聚合酶链反应扩增(Sox9上山生物公司),Trizol总RNA提取试剂(北京游引物:5’-TGTGAACTGGTAGATCTG
鼎国生物公司),聚合酶链反应引物(上海生物GT-3’,下游引物:5’-AAGAAGTGGAAT
工程技术公司)。
AAGTGGGCT-3’
,聚合酶链反应product设计、实施、评估者:为通讯作者,目前承size:292bpⅡ型胶原上游引物5’-TGTGAA
担软骨发生过程中基因表达谱的测定及相关CTGGTAGATCTGGT-3’
,下游引物:5’研究等8项科研课题,是本项实验设计与总体-AAGAAGTGGAATAAGTGGGCT-3’
,指导者。
聚合酶链反应productsize:448bp方法:
Aggrecan上游引物:5’-TGAAGAAGA
脂肪干细胞的分离纯化及培养:Wistar大AGAAGGGTTAGG-3’
,下游引物:5’-AGC鼠麻醉状态断颈处死,无菌条件下取出腹股沟AGTAGGAGCCAGAGTTAT-3’
,聚合酶链处脂肪,尽量剔除软组织和小血管,磷酸盐缓反应productsize:322bp)。聚合酶链反应产
冲液冲洗,用剪刀将脂肪组织剪成小块,含
物用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
30%抗生素的DMEM浸泡30~50min,磷酸Western-blot检测:收集细胞制备总蛋
盐缓冲液冲洗,再以0.75g/LⅠ型胶原酶37℃白,按常规方法进行100g/L聚丙烯酰胺凝胶消化30min,等体积体积分数为0.1的胎牛血(SDS-PAGE)变性转移至硝酸纤维素滤膜上,清的DMEM中和,1000g离心10min弃上50g/L脱脂奶粉封闭。依次滴加一抗(Ⅱ型胶清,160mmol/LNH4Cl裂解红细胞10min,离原抗体1∶500),二抗为辣根过氧化物酶标记的心弃上清,DMEM重悬细胞,筛网过滤后离心,羊抗兔IgG(1∶500),最后采用ECL系统感光
接种至含DMEM/体积分数为0.15的胎牛血清显像观察结果。
的培养瓶中。细胞传至第3代后,进行诱导。
主要观察指标:①细胞形态变化。②阿辛脂肪干细胞体外成软骨细胞诱导分化培蓝染色结果。③Ⅱ型胶原免疫组织化学染色结养:10μg/L转化生长因子β1、1×10-7mol/L地果。④诱导组和对照组反转录-聚合酶链反应塞米松、50mg/L维生素C、高糖DMEM配制检测结果。⑤Ⅱ型胶原表达的Westernblot检成细胞诱导液。以2×104/cm2细胞密度接种于
测。
24孔板,诱导组为第3代细胞接种12h后加
入诱导液,每3天换液1次,诱导14d;对照2结果
组为第3代细胞接种后在含体积分数为0.15的胎牛血清的DMEM培养液中常规培养。倒
2.1
脂肪干细胞形态变化
细胞接种的最初
置显微镜观察细胞形态。
几日,细胞呈圆形,24h内可见体积较大的单细胞化学染色:诱导培养时培养孔内预先个核细胞贴壁,48h后贴壁细胞开始分裂增放置盖玻片,使细胞贴盖玻片生长,至14d时殖,部分区域形成细胞团簇,细胞呈现成纤维取出细胞爬片,阿辛蓝染色观察细胞糖胺聚糖细胞梭形外观。1周后贴壁细胞呈长梭形,体分泌情况。
积增大;14d后贴壁生长细胞基本长满单层,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色:细胞爬片用
中心细胞排列紧密,形态与骨髓间充质干细胞预温的磷酸盐缓冲液洗2次,丙酮/乙醇(1∶1)相似。诱导培养后,细胞形态逐渐由梭型向多内固定5~15min;磷酸盐缓冲液漂洗3次,体
角形、多边形转变。诱导14后多数细胞呈平坦
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徐亮,等.脂肪干细胞在体外特定培养液中向软骨细胞表型的分化
CRTER
应用要点:①实验采用胶原酶分次消化的方法,不但使标本消化完全,而且避免了使用胰酶所造成的细胞毒性,同时分离获得了大量细胞,并且通过换液的方法去除了红细胞等非贴壁细胞,获得了良好的效的多边角形状细胞;其夹杂多角突起状或多角纺锤状细胞。
现了向软骨细胞表型分化的现象并合成了软骨细胞特异性基质,从而证实了从脂肪组织中可以获得具有多向分化潜能的间充质干细胞,经诱导后可定向分化为软骨细胞,有可能成为软骨组织工程中新的种子细胞来源。
2.2诱导培养14d后细胞阿辛蓝染色结果
诱导组,阿辛蓝染色结果阳性反应,细胞呈绿色长梭型,细胞轮廓清晰可见。
2.3诱导培养14d后细胞Ⅱ型胶原免疫组
诱导组细胞Ⅱ型胶原免疫
织化学染色结果4
参考文献
组织化学染色结果呈阳性反应,细胞浆呈棕褐色,说明诱导组表达了软骨细胞的表型Ⅱ型胶原蛋白,可证实为软骨细胞,对照组为阴性反应,未见棕褐色细胞。
2.4诱导组和对照组反转录-聚合酶链反应
检测结果
诱导组经反转录-聚合酶链反应检
测后,可见到聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原与Sox9扩增产物明显的条带,而对照组(常规培养组)则未见表达。
2.5
Ⅱ型胶原表达的Westernblot检测结果诱导组细胞的胞质中,可检测到Ⅱ型胶原的表达条带,而对照组(常规培养组)细胞未检测到Ⅱ型胶原的表达。
3
讨论
转化生长因子β1是一种多功能的细胞因子,可以显著提高软骨细胞表型,促进培养软骨细胞表达Ⅱ型胶原和蛋白多糖[11,12]。对分化末期的软骨细胞,转化生长因子β1则抑制其分化并抑制软骨基质的合成与钙化,抑制碱性
磷酸酶活性
[13]
。
在软骨分化发育过程,Sox9是调控软骨发生的主要转录因子
[14]
,Sox9和软骨细胞特
异基因Ⅱ型胶原共同表达[15]
。Sox9在体内和
体外均可结合并促进Ⅱ型胶原基因的表达,而且Sox9异位表达亦可导致内源性α1(Ⅱ)型胶原基因的上调[16]。Sox9结合软骨细胞特征分子Ⅱ型胶原、aggrecan蛋白的增强子元件,激活表达,从而调控软骨分化
[17-20]
。在本实验
中,转化生长因子β1诱导组的间充质细胞中检测到Sox9和Ⅱ型胶原基因的表达。
Western免疫印迹对蛋白水平的检测结果也显示出与Ⅱ型胶原基因表达结果的一致性,提示转化生长因子β1正向调节软骨细胞特异性基因Sox9和Ⅱ型胶原基因的表达,从而促进Sox9和Ⅱ型胶原的合成。
通过本实验发现,脂肪组织来源的成体干细胞通过转化生长因子β1的诱导条件下,出
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果。②实验发现,脂肪组织来源的成体干细胞通过转化生长因子β1的诱导,出现了向软骨细胞表型分化的现象并合成了软骨细胞特异性基质,从而证实了从脂肪组织中可以获得具有多向分化潜能的间充质干细胞,经诱导后可定向分化为软骨细胞。
同行评价:干细胞
诱导分化研究是国际研究的热点课题。应用细胞因子和特殊培养基,诱导脂肪干细胞体外定向分化为软骨细胞,实验设计较为合理,技术路线清晰,所用检测方法如蛋白杂交、核酸杂交等方法较为先进,值得借鉴。
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