制药实验总结

1、溶液1，2，3，的作用？

溶液Ⅰ的作用：悬浮大肠杆菌菌体，而且加溶液I 后，必须要将菌体悬浮彻底，不得有块状大颗粒状呈现，是质粒DNA 提取的首要关键。且其中含有的溶霉菌可以水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌作用。

溶液2、提供碱性条件，在NaOH 与SDS 的共同作用下使大肠杆菌瞬间裂解，并变性核DNA 。当细胞悬浮于NaOH 和十二烷基酸钠（SDS ）溶液中使，在高pH （碱性环境）的作用下细胞发生裂解，此外蛋白质和染色体DNA 发生变性与细胞碎片一起沉淀下来。

溶液3：（醋酸钾和醋酸），该溶液所含有的高浓度钾离子与溶液体系中的十二烷基硫酸钠（即SDS 与NaOH 所形成的可溶性物质）发生反应形成十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate,PDS ），从而将与之结合的绝大部分大肠杆菌蛋白质以及很长的基因组DNA 一起沉淀沉淀，与质粒分离开来；中和氢氧化钠使质粒DNA 复性。

因为基因组DNA 太长了，长长的DNA 自然容易被PDS 给共沉淀了，尽管SDS 并不与DNA 分子结合。

2、各试剂的作用？

溶液1、葡萄糖的作用是使悬浮后的大肠杆菌不会很快沉积到管子的底部，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA 受机械剪切力作用而降解。EDTA 是Ca2+ 和Mg2+等二价金属离的螯合剂，在溶液I 中加入EDTA ，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉，从而起到抑制 DNase 对DNA 的降解和抑制微生物生长的作用。另外也可保证溶菌酶活性。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH ，因此用适当浓度的和适当pH 值的Tris-Cl 溶液，是再自然不过的了

溶液2、提供碱性条件，在NaOH 与SDS 的共同作用下使大肠杆菌瞬间裂解，并变性核DNA 。当细胞悬浮于NaOH 和十二烷基酸钠（SDS ）溶液中使，在高pH （碱性环境）的作用下细胞发生裂解，此外蛋白质和染色体DNA 发生变性与细胞碎片一起沉淀下来。

溶液3、醋酸中和碱。

25/24/1的酚/氯仿/异戊醇：

A ．水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液，离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；

B ．酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应。而且含质粒DNA 的水相会部分进入到酚中，造成损失！ C ．添加异戊醇，主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，方便了水相的回收。

无水乙醇：回收后的水相含有足够多的盐，DNA 在无水乙醇中的溶解度小，因此只要加入2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA 沉淀出来。

70%乙醇：如果感觉发生了盐的沉淀，就用70％的乙醇多洗几次。（除盐）

，

3、注意事项

（2）用不新鲜的0.4 M NaOH ，即便有SDS 也无法有效溶解大肠杆菌。因此必须使用新鲜的0.4 M NaOH 试剂进行配制。

（3）SDS 易产生气泡，不要剧烈搅拌。

（4）变性时间不宜过长。

（5）用移液器操作时一定要小心，特别是加入溶液二、三后一定不要剧烈震荡，以免切碎

DNA 。

质粒DNA 的酶切鉴定及琼脂糖凝胶电泳

1、限制性核酸内切酶的特性，在基因工程中的作用？

特性（基因工程）、定义。

作用基因工程的重要工具，能切割DNA 获得目的基因，切割质粒留下连接位点。 此外，双切酶能保证基因的定向插入，提高重组率。

产生粘性末端惑平末端。

目前, 基因工程上, 限制酶主要应用于以下两方面

（1）目的基因与载体的重组

细菌细胞中的限制酶能水解外源DNA , 因此必须通过适当的载体(质粒或噬菌体) 的帮助才能将外源DNA 引人受体细胞并在其中增殖和表达。将供体DNA 与载体用同样的限制酶处理, 使载体带上各种各样的外源DNA 片断, 然后引人受体细菌细胞增殖, 菌细胞增殖, 再筛选出所需的菌株, 便获得带有某一目的基因的繁殖系. 用这种方法, 已成功地将酵母菌的咪哇甘油磷酸脱水酶基因、夕一异丙基苹果酸脱氢酶基因和色氨酸合成酶基因通过几噬菌体转人大肠杆菌。

2）建造新的基因载体作为基因载体, 在引人受体细胞后, 必须有较高的复制率, 以求获得大量的基因产物；必须具备一个选择性标志, 以便筛选；还要有一至多种限制酶的作用位点（每种酶只有一个切口）；

2、琼脂糖凝胶电泳的注意事项?

一、配胶：

1、电子称的使用，要时刻保持电子称的精确性，清洁性，根据不同浓度的胶配置琼脂糖。

2、加TAE 的量要适当，以免配出的胶太薄导致胶孔太浅或浓度太低。

3倒胶前，胶托要洗干净，并擦干，倒胶时要待胶冷到一定温度摇匀，尽量不要产生气泡。若胶的温度过高要顶着胶托，防止胶变形。

二、点样电泳

1孔板要干净，loading 点样要均匀，控制1~2ul的量，并做好对应标记。

2点样后及时盖上胶垫注意不要盖反。

5加样时枪头要上紧，吸样均匀准确，排液时枪头不要有残留

3点电泳前要检查胶是否合格，点样要对准胶孔，尽量点完所有的样。

4不要忘记点marker 并摆正胶位，正负极不要接反。

三、EB 染色

1切胶要准，取胶要稳，泡胶要慎以免EB 溅起。

2碰到EB 的手套要及时丢弃

3 EB要适时更换，盘子及时清洗

4抹布要分清，不可交叉使用。

四、图像分析仪的使用

1使用前要清洁，避免影响胶图清新度。

2 照胶时应经量减少开紫外灯的时间。

5观察时要带防护眼镜，避免眼睛被紫外损伤。

3拍照时先关摄像头再关紫外灯，严格按照照胶流程操作。

4照好的胶要及时丢弃。

3、胶回收试剂盒在回收DNA 时各试剂的作用？

PCR

一、降低退火温度对反映有何影响？ 1在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火， 同时还要足够高，以减少非特异性结合。

2如果温度过低，扩增特异性差，杂带较多，背景深。

3 PCR扩增在变性阶段吸热, 在退火和延伸阶段放热, 每一个PCR 循环呈现放热效应, 同时退火温度高导致平台期的前移和焓值的降低,

4、退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。

二、延长变性时间对反映有何影响？

变性时间延长会导致酶活性的降低。

GC 含量过高的片段，可以适当延长变性时间。

三、循环次数是不是越多越好？

不是的，随着反应的进行，酶会逐渐失活、dNTP 等原料会逐渐消耗掉。

PCR 敏感性太高, 循环过多容易产生假阳性结果，比方说把试剂中原本极其微量的杂质序列片段放大扩增，影响对正常结果的判断。

因此在一定范围内，随着反应循环数的增加，产物会增多；但超过了就不好了。一般设置30-35个循环就很够了

四、PCR 的五大元素？

参加PCR 反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP 、模板和Mg2+ 引物：

引物是PCR 特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA 互补的程度。 设计引物应遵循以下原则：

①引物长度： 15-30bp，常用为20bp 左右。

②引物扩增跨度： 以200-500bp 为宜，特定条件下可扩增长至10kb 的片段。

③引物碱基：G+C 含量，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC 最好随机分布，避免核苷酸的成串排列。

④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3' 端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

⑤引物3' 端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR 失败。

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。

⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

(2)酶及其浓度 目前有两种Taq DNA 聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR 反应约需酶量2。5U(指总反应体积为100ul 时) ，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

(3)dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR 扩增效率有密切关系，dNTP 粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP 溶液呈酸性，将其PH 调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP 降解。尤其是注意4种dNTP 的浓度要相等( 等摩尔配

制) ，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低) ，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR 产物的产量。dNTP 能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。

(4)模板(靶基因) 核酸 模板核酸的量与纯化程度，是PCR 成败与否的关键环节之一，传统的DNA 纯化方法通常采用SDS 和蛋白酶K 来消化处理标本。SDS 的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶K 能水解消化蛋白质，特别是与DNA 结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR 反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR 扩增。RNA 模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K 法，要防止RNase 降解RNA 。

(5)Mg2+浓度 Mg2+对PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响，Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。 酵母菌原生质体的分离与再生

高压蒸汽灭菌的注意事项？（微生物实验）

第一，无菌包不宜过大(小于50cm ×30cm ×30cm) ，不宜过紧，各包裹间要有间隙，使蒸汽能对流易渗透到包裹中央。消毒前，打开贮槽或盒的通气孔，有利于蒸汽流通。而且排气时使蒸汽能迅速排出，以保持物品干燥。消毒灭菌完毕，关闭贮槽或盒的通气孔，以保持物品的无菌状态。

第二，布类物品应放在金属类物品上，否则蒸汽遇冷凝聚成水珠，使包布受潮。阻碍蒸汽进入包裹中央，严重影响灭菌效果。

⑥瓶装液体灭菌时，要用玻璃纸和纱布包扎瓶口；如有橡皮塞时，应插入针头排气；⑦应有专人负责，每次灭菌前，应检查安全阀的性能，以防压力过高发生爆炸，保证安全使用；