应用免疫学基本原理

免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应, 即抗原与抗体特异性结合的原理, 通过化学反应使标记抗体的显色剂(酶、荧光素、金属离子、同位素) 显色来确定组织、细胞内抗原(多肽和蛋白质), 对其进行定位、定性及定量的研究, 称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry,IHC)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry,ICC).

一、标本制备

石蜡切片:组织取材、固定、包埋, 切片(一般的组织化学染色切片厚度要求5～7 µm,常规病理切片2～3 µm)

二、实验试剂

PBS、柠檬酸三钠•2H2O 、30%H2O2、柠檬酸、山羊血清、第一抗体、第二抗体

三、操作步骤:

1) 常规石蜡切片脱蜡至水

2) PBS 洗 3次,5分钟/次.

3) 抗原修复:用0.1M 柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)于微波炉(750W煮沸3分钟,90W11.5分

钟) 修复后, 组织切片自然晾至室温.

4) 封闭内源性过氧化物酶:3%H2O2室温湿盒孵育10分钟.

5) PBS 洗3次,5分钟/次.

6) 正常山羊血清室温湿盒封闭30分钟.

7) 一抗孵育:将组织切片于稀释的一抗溶液中4℃湿盒孵育过夜.

8) 室温复温15分钟.

9) 1PBS 洗 3次,5分钟/次.

10) 二抗室温湿盒孵育30～60分钟.

11)PBS 洗 3次,5分钟/次.

12)DAB 显色, 室温1～10分钟, 显微镜下掌控.

13)ddH2O 洗 3次,5分钟/次.

14) 苏木素复染1～10分钟,1％盐酸酒精分化, 显微镜下掌控.

15) 脱水:95％乙醇2次,10分钟/次→无水乙醇2次,10分钟/次.

16) 透明:二甲苯2次,10分钟/次.

17) 中性树胶封片.

1、载玻片的处理：

抗原修复过程中, 由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响, 极易造成脱片. 为保证试验的正常进行, 可选用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂, 对已清洗的载玻片进行处理. 具体方法如下：

1.1 APES：

现用现配. 将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES 中, 停留20~30秒钟, 取出稍停片刻, 再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES, 置通风橱中晾干即可. 用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位, 并尽量减少气泡的存在, 以免影响染色结果.

1.2 HistogripTM：

将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip 液中, 停留1~2分钟, 然后用双蒸水快速清洗三次, 室温干燥或60oC 烤箱烘烤一小时, 装盒备用.

1.3 Poly-L-Lysine：

将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中, 浸泡5分钟,60oC 烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥. 装盒备用. 试验中使用的器具均为非玻璃制品.

2、常用酶消化：

2.1 胰蛋白酶：

一般使用浓度为0.05%~0.1%,消化时间为37℃、10~40分钟, 主要用于细胞内抗原的显示.

2.2 胃蛋白酶：

一般使用浓度为0.4%,消化时间为37℃、30~180分钟, 主要用于细胞间质抗原的显示, 如：Laminin （层粘蛋白）,Collagen IV（IV 型胶原）等.

2.3 皂素（Saponin ）：

g/ml的saponin 溶液, 消化时间为室温孵育30分钟. 一般使用浓度为2~10

3、抗原热修复：

可根据实验室的具体条件, 选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复. 抗原热修复可选用各种缓冲液, 如TBS 、PBS 、重金属盐溶液等, 但实验证明, 以0.01M 枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好. 请选用我公司提供的ZLI-9064 0.1,如因蒸馏水本身造成的pH 值偏差, 请自行调整. 枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制, 取该粉剂一包溶于1000ml 的蒸馏水中, 混匀, 其pH 值在6.0

3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：

切片脱蜡至水后,3％H2O2处理10分钟, 蒸馏水洗2分钟×3. 将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中, 置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉, 请根据具体机型酌情设置条件, 务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）. 取出容器, 室温冷却10~20分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却, 以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）.PBS 洗, 下接免疫组化染色步骤.

3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法：

切片脱蜡至水. 将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾. 切片置于金属架上, 放入锅内, 使切片位于液面以下, 盖锅压阀. 当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后）, 计时1~2分钟, 然后将压力锅端离热源, 冷水冲至室温后, 取下气阀, 打开锅盖, 取出切片, 蒸馏水洗后,PBS 洗2分钟×3, 下接免疫组化染色步骤.

3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：

切片脱蜡至水后, 放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中, 并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中, 电炉上加热煮沸, 从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟, 然后端离电炉, 室温冷却20~30分钟, 蒸馏水冲洗,PBS 洗, 下接免疫组化染色步骤.

4、免疫组化染色步骤：

1)

2)

3)

4)

5) （以美国ZYMED 公司SP 试剂盒为例） 石蜡切片脱蜡至水. 3%H2O2室温孵育5~10分钟, 以消除内源性过氧化物酶的活性. 蒸馏水冲洗,PBS 浸泡5分钟,(如需采用抗原修复, 可在此步后进行). 5~10％正常山羊血清（PBS 稀释）封闭, 室温孵育10分钟. 倾去血清, 勿洗, 滴加适当比例稀

释的一抗或一抗工作液,37℃孵育1~2小时或4℃过夜.

6) PBS 冲洗,5分钟×3次.

7) 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释, 37℃孵育10~30分钟；或滴加第

二代生物素标记二抗工作液,37℃或室温孵育10~30分钟.

8) PBS 冲洗,5分钟×3次.

9) 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS 稀释, 37℃孵育10~30分钟；或第二代

辣根酶标记链霉卵白素工作液,37℃或室温孵育10~30分钟.

10) PBS 冲洗,5分钟×3次.

11) 显色剂显色（DAB 或AEC ）.

12) 自来水充分冲洗, 复染, 封片.