糖的检测方法凯氏定氮法蛋白质核酸

糖的检测方法

糖类化学检测主要是利用游离羰基的还原性质，与试剂（氧化剂）进行氧化还原反应而进行测定的。 非还原糖必须转化为还原糖再进行测定。

最常用的试剂：斐林（Fehling）试剂

基本组成：A：CuSO4溶液B: NaOH和酒石酸钾钠溶液

使用时A、B等体积混合(生成酒石酸钾钠铜）

酒石酸钾钠铜是氧化剂，可与还原糖的游离羰基发生氧化还原反应，而进行糖的测定。

1.兰-爱农（LANE-EYNON）法---次甲基蓝（亚甲基蓝、四甲基蓝）法、置换法、直接滴定法

反应终点用次甲基蓝指示剂显示（还原糖滴定斐林试剂，由于次甲基蓝氧化能力比二价铜弱，待二价铜全部还原后，过量还原糖使次甲基蓝还原，蓝色消失）

多糖或其他非还原糖需转化为还原糖后再滴定 如淀粉，可用酸解或酶解

操作要点

（1 ）斐林试剂的标定

（a）标定预备试验A、B各5mL＋10mL水（250mL三角瓶中）摇匀，加热至沸腾，＋2D1％次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，耗标准葡萄糖液（0.1％或0.2％）V1mL。

（b）标定A、B各5mL＋10mL水（250mL三角瓶中）摇匀，从滴定管中预先加入（V1-1)mL标准葡萄糖液，摇匀后加热加热至沸腾，＋2D1％次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失（滴定在1min内完成），记录消耗标准葡萄糖液的总毫升数V0

(2) 定糖

（a）定糖预备试验A、B各5mL＋10mL样品糖液（250mL三角瓶中）摇匀，加热至沸腾，＋2D1％次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，耗标准葡萄糖液（0.1％或0.2％）V2mL。

（b）定糖A、B各5mL＋10mL样品糖液（250mL三角瓶中）摇匀，补加（V0-V2）mL水，并从滴定管中预先加入（V2-1)mL标准葡萄糖液，摇匀后加热加热至沸腾，＋2D1％次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失（滴定在1min内完成），记录消耗标准葡萄糖液的总毫升数V

(3) 计算

还原糖含量（以葡萄糖计）

＝（V0-V) × c × (1/10 )×n

注意：

（a）AB分开储存，防止Cu2+变化，临用混合

（b）单标移液管吸液准确，外壁也需擦干净

（c）体积需控制在一定范围内，对pH有影响

（d）煮沸时间要一致

（e）注意指示剂加入时间和加入量一致

（f）滴定速度一致（后滴定0.5～1mL，1min内完成）

（g）产物Cu2O不稳定，次甲基蓝变色也不稳定，暴露于空气或沸腾颜色变化，滴定过程不能摇动，不可中途中止加热

2、斐林试剂快速法：

在斐林试剂中加入亚铁氰化钾（黄血盐）反应终点为蓝色消失，淡黄色出现。反应终点比兰－爱农法更为明显。

3、 碘量法

I2→ NaIO(氧化剂），其氧化能力较弱，仅适用于醛糖的测定，与酮糖不起反应

操作要点：

（1）标准硫代硫酸钠溶液配制，0.05 mol/L，沸腾后冷却水配制，存放在棕色瓶中，一周后用标准重铬酸钾标定。

（2）标准碘液配制，0.1mol/L

（3）空白滴定：空白液，用硫代硫酸钠滴定试剂中全部碘

碘量瓶中，10mL 0.1mol/L碘液＋15mL 0.1 mol/LNaOH＋5mL空白液，摇匀后暗反应15min＋1mL1mol/L硫酸溶液，用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定至浅黄色，加0.2mL0.5％淀粉液作指示剂，滴定至蓝色消失，记录V0

(4)样品滴定：以5mL样品液代替空白液， V1

(5) 计算：醛糖含量＝ （V0 － V1）C× M × n

注意：暗反应后需酸化再滴定，滴定时开始轻摇（碘挥发），后再摇（淀粉吸附碘）

配合次甲基蓝法测定某些糖含量（如果糖）

4. 铜试剂法

将还原糖与二价铜离子反应生成的Cu2O用碘氧化，再用硫代硫酸钠滴定反应液中剩余的碘而测定样品还原糖的含量。

（1）铜试剂的配制主要提供二价铜离子及碘

（2）标准曲线的制作

（a)标准葡萄糖液的配制

0.1%或0.05％（根据所用铜离子试剂定）

（b)三角瓶编号 1 2 3 4 5 6

葡萄糖标准液（mL ) 0 1 2 3 4 5

蒸馏水（mL ) 5 4 3 2 1 0

铜试剂（mL ) 5 5 5 5 5 5

沸水浴10min，冷却至室温

(c)各加入0.5mol/L硫酸5mL，振荡，待红色Cu2O完全溶解后，用硫代硫酸钠滴定至终点，记录耗用量V (d) 绘标准曲线葡萄糖含量（mg）为纵坐标，（V0-V)为横坐标

第二节蛋白质和氨基酸的化学检测

蛋白质含氮量几乎恒定，平均16％

测出N含量×6.25，即为蛋白质量

1 定氮法（经典的，仲裁的）

常用凯氏定氮法或微量凯氏定氮法

（1）原理

消化、蒸馏、吸收、滴定计算

有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4 作用下，硝化生成（NH4）2SO4 凯氏定氮法

反应式为：

2NH2+H2SO4+2H=(NH4)2SO4 （其中CuSO4做催化剂）

2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于H3BO3 溶液中

反应式为:

(NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O

3. 用已知浓度的H2SO4（或HCI）标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量

反应式为：

(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=(NH4)2SO4+4H3BO3

(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3

（2）操作要点

(a) 消化：凯氏定氮瓶，样品＋K2SO4-CuSO4、浓H2SO4, 通风厨内进行，消化液全部移入100mL容量瓶定容。

(b)蒸馏：防止漏气

(c)吸收：5mL2％H3BO3＋甲基红－溴甲酚绿几滴或一定量标准酸溶液（如25mL 0.05mol/L H2SO4) (d)滴定计算：

H3BO3吸收：0.01mol/LHCl滴定至绿色→ 淡紫红色

样品中的总氮量（mg)=（A-B)×C×14×n

标准硫酸接收：0.1mol/L标准NaOH滴定，甲基红→黄色终点

样品中总氮量=（2C1V1-C2V2) ×14×n

粗蛋白含量＝样品的总氮量×6.25

2 双缩脲试剂法测定蛋白质

缩脲＋CuSO4、NaOH→ 紫红色化合物

蛋白质含有两个以上脲键，有双缩脲反应

蛋白质（多肽）＋ CuSO4 →（ NaOH） →铜－钠－双缩脲络合物

颜色深浅∝ Cp，与蛋白质的分子量和氨基酸组成无关

Tris缓冲液干扰P的测定，测定范围1～10 mg/mL

操作：

（1）双缩脲试剂的配制

CuSO4、酒石酸钾钠、NaOH、0.1%KI

(2) 标准曲线的制作

1％标准酪蛋白(mL) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

蒸馏水(mL) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0

双缩脲试剂 (mL) 4 4 4 4 4 4

室温反应30min测A540

(3)样品测定 1mL＋4mL双缩脲试剂 ，30min，测A540

3 福林－酚试剂法测定蛋白质含量

双缩脲法的发展，灵敏100倍，需时较长，对双缩脲反应有干扰的物质对其影响更大，酚类和柠檬酸也有干扰。

碱性铜试剂——双缩脲反应

稀释的苯酚试剂——与酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸反应呈蓝色

两种呈色反应可叠加

操作：

（1）福林－酚试剂的配制

甲液：碱性铜试剂（A、NaOH、NaCO3, B、CuSO4和酒石酸钾钠)

乙液：稀释的苯酚试剂

（2）标准蛋白溶液配制

结晶牛血清蛋白溶于0.9％NaCl或用酪蛋白（凯氏定氮法测定含量）

（3）标准曲线制作

（4）样品测定

1mL样品（含P15～500 μ g）＋5mL甲液，室温10min，＋乙液0.5mL，混匀，室温30min，测A500~750

4. 蛋白质N-氨基酸DNS测定法

5. 蛋白质的氨基酸排列顺序测定——EDMAN法

实验原理

2,4-二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene, DNFB）也叫做Sanger试剂。DNFB在弱碱性溶液中与氨基酸发生取代反应，生成黄色化合物二硝基苯基氨基酸（dinitro phenyl amino acid, DNP氨基酸）

7. 茚三酮显色法测定氨基酸含量

茚三酮溶液与氨基酸共热，生成氨。氨与茚三酮和还原性茚三酮反应，生成紫色化合物（亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）茚三酮反应生成黄色化合物）。颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，可通过测定570nm处的光密度，测定氨基酸的含量

取1mL样品溶液（含氨基酸0.1～50ug)加1mL缓冲液（pH5.0～6.7），再加1mL茚三酮显色液，100℃ 水浴15min，自来水冷却后，加入3mL60％乙醇溶液，测定OD570，脯氨酸或羟脯氨酸测OD440

8. 甲醛滴定法测定氨基酸

第三节 蛋白质的免疫化学检测

利用抗原与抗体之间特异的结合反应而对蛋白质进行定性定量分析的技术

抗体的单体是一个Y形的分子，有4条多肽链组成。其中包括两条相同的重链，以及两条相同的轻链，之间由双硫键连接在一起

凝集反应

颗粒性抗原（完整的病原微生物或红细胞等）与相应抗体结合，在有电介质存在的条件下，经过一定时间，出现肉眼可见的凝集小块。

参与凝集反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。可分为直接凝集反应和间接凝集反应两类

抗原滴度：免疫血清在一定量抗原存在下能显现明确 的沉淀反应的最大稀释度的倒数。——抗体（抗血清）效价

沉淀反应

可溶性抗原与相应抗体在有电解质存在的情况下，按适当比例所形成的可见沉淀物现象。

沉淀温度：体温（37）或室温（25）

沉淀pH： 6.5-8.6

离子强度：生理盐水（0.9%NaCl），》0.15mol/L

时，盐浓度增加，沉淀减小

第四节 核酸的化学检测

根据核酸所含的磷及戊糖的化学性质，可用定磷法、二苯胺法和地衣酚法等进行检测。

1. 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸含量，反应灵敏。

2. 紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰，操作简便，受蛋白质和核苷酸的干扰影响。

3. 地衣酚法：用于测定RNA的含量，RNA与浓盐酸共热，降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定，特异性差，戊糖均有此反应。

4. 二苯胺法：DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为ω-羟-γ-酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应，除脱氧木糖和阿拉伯糖外其他糖类无此反应。