纯种发酵淡豆豉对小鼠的微生态的调节作用研究

　　【摘 要】目的：观察纯种发酵淡豆豉对小鼠肠道微生态的影响。方法：盐酸林可霉素灌胃建立小鼠肠道菌群失调模型，然后用纯种发酵淡豆豉进行治疗，同时设立正常对照组、自然发酵淡豆豉治疗组、阳性对照组（丽珠肠乐治疗组）和模型对照组，比较其治疗效果。结果：林可霉素灌胃3d后，小鼠肠道菌群失调。持续淡豆豉7d治疗后，小鼠肠道双歧杆菌和乳酸杆菌数量明显上升。结论：应用林可霉素可以成功建立肠道微生态失调动物模型；纯种发酵淡豆豉具有扶植肠道正常菌群生长，调整菌群失调的作用，且作用明显优于自然发酵淡豆豉。　　【关键词】淡豆豉；纯种发酵；微生态；肠道菌群　　【中图分类号】R284 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2012）13-0007-01　　肠道菌群是构筑肠道粘膜屏障的主要成分，为机体抵御病原菌的侵袭提供了强大的生物屏障。然而在目前大量应用广谱抗生素、外科大手术等条件下，肠道正常菌群遭到严重破坏，使肠道菌群成了细菌耐药性产生和传播的疫源地。近年来研究发现，一些中药具有扶植正常菌群生长，改善菌群失调的作用，是良好的微生态调节剂[1]。淡豆豉是一种发酵性中药，是由于大豆经微生物发酵后改变其药物原有性能，产生新的治疗作用。现代研究表明，常服豆豉有助于消化、提高抗病能力、减缓衰老、消除疾劳等多种作用，但具体机制和活性成分不清楚。目前市售中药淡豆豉均为自然发酵淡豆豉，存在着杂菌污染、质量无法有效监控等缺陷，我们前期对淡豆豉进行了纯种发酵的研究，发现纯种发酵淡豆豉生物活性成分的含量大大高于自然发酵淡豆豉[2]。本文探讨纯种发酵淡豆豉对肠道菌群的调整作用。　　1 实验材料　　1.1 实验动物 昆明种小鼠，70只，雌雄各半，体重20±2g，由贵阳医学院实验动物中心提供。　　1.2 药物 盐酸林可霉素（300g/L），上海旭东海普药业有限公司；丽珠肠乐，珠海丽珠制药厂，用生理盐水稀释成2×108个活菌/ml；黄豆，市售。　　1.3 培养基 EMB（肠杆菌选择性培养基）；EC（肠球菌选择性培养基）；LBS（乳酸杆菌选择性培养基）；BS（双歧杆菌选择性培养基），购自青岛海博生物技术有限公司。　　1.4 仪器 II级生物安全柜，厌氧培养箱，电子天平等。　　2 实验方法　　2.1 纯种发酵淡豆豉制备 市售大豆用饮用水室温浸泡过夜，滤干水后0.1Mpa高压蒸煮30min，用实验室保存的淡豆豉发酵菌株培养液按2%接种量接种在高压过的大豆中，摇匀后32℃恒温培养7天。发酵完成后的淡豆豉样品分别置于60℃干燥、粉碎、过60目筛，使用时配成1g/ml的混悬液。　　2.2动物分组及给药 按文献方法[3]，昆明种小鼠随机抽取20只作为正常对照组，其余50只随机分为模型对照组、纯种发酵淡豆豉治疗组、自然发酵淡豆豉治疗组和丽珠肠乐治疗组，其中模型对照组20只，其余各组为10只，均用盐酸林可霉素灌胃，每次0.3ml，每天2次，连续3天，正常对照组以等量生理盐水灌胃。第4天，处死正常组小鼠和模型组小鼠各10只，进行肠道菌群检测，以判断模型是否构建成功。各组小鼠模型制备成功后，分别以药物灌胃，每次0.5ml，每天2次，正常对照组和模型对照组则灌以等量生理盐水。连续灌胃7d后处死，取标本进行各种指标检测。　　2.3 肠道菌群检测 无菌条件下取盲肠内容物0.05g置于装有玻璃珠的无菌小瓶内，加0.45ml生理盐水，于振荡器上振荡20min，使盲肠内容物均质化。随后用生理盐水进行10倍系列稀释至10-9倍。选择稀释度：肠杆菌（10-3、10-4、10-5）、肠球菌（10-4、10-5、10-6）、乳酸杆菌（10-6、10-7、10-8）、双歧杆菌（10-7、10-8、10-9）， 吸取每个稀释度的标本10μl滴于培养基上，EMB、EC、LBS、BS培养基各滴3滴，放置10min后，将BS及LBS放于厌氧培养箱中，厌氧培养48～72小时，将EC及EMB置于温箱中，需氧培养24小时。活菌计数：计算活菌数（CFU）/g标本，选择菌落中适宜的稀释度，算出同一稀释度平均菌落数（X）。　　2.4 统计学处理 结果用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用SPSS10.0统计软件进行方差分析。　　3 实验结果　　3.1 经过林可霉素灌胃3d后，模型组小鼠与正常组比较，肠道菌群数量发生明显改变，其中双歧杆菌和乳酸杆菌数量明显下降（P�0.01，P�0.05），而肠杆菌和肠球菌显著升高（P�0.05），说明模型组小鼠经过林可霉素作用后出现菌群失调，结果见表1。　　3.2 菌群失调小鼠经过淡豆豉和丽珠肠乐治疗后，肠道菌群失调症状得到缓解，各治疗组双歧杆菌、乳酸杆菌数量明显上升，肠球菌、肠杆菌数量明显下降，与模型对照组比较，差异有显著性（P�0.05）。同时纯种发酵淡豆豉疗效显著强于自然发酵淡豆豉，与丽珠肠乐差异无显著性。结果见表2。　　4 讨论　　淡豆豉是一种发酵性中药，是由于大豆经微生物发酵后改变其药物原有性能，产生新的治疗作用。历代医书中都有豆豉治疗消化系统疾病的记载，汉代张仲景的《伤寒论》中即有“桅子豉汤”，方中用桅子、豆豉煎汤治疗外感风寒、不思饮食等症；李时珍的《本草纲目》中则有“豆豉具开胃增食、消食化滞、发汗解表、除烦喘等疗效”的记载。现代研究表明，常服豆豉有助于消化、提高抗病能力、减缓衰老、消除疾劳等多种作用。研究表明，大豆约含有10%的大豆低聚糖，具有调整肠道正常菌群，促进有益菌生长，抑制腐败菌生长的作用，但大豆中的低聚糖纯度低，对肠道功能的改善效果不明显。中药淡豆豉是大豆经微生物发酵而成的，我们经过大量的研究，发现大豆中含有的生物活性成分在淡豆豉中的含量和种类都有较大改变。尤其是纯种发酵的淡豆豉，由于没有其他杂菌的影响，生物活性成分的含量大大高于自然发酵的淡豆豉。　　随着微生态学的发展，人们已经认识到肠道正常菌群，特别是双歧杆菌、乳酸菌等对维护一个肠内环境及机体的健康具有重要作用。鉴于活菌补充在定植力、活菌存活率、运输、保存等方面的不足，开发应用能促进肠道内有益菌生长、调整肠道菌群结构且有价廉质优、易被接受的新药，是我国微生态保健品的发展方向[4]。本实验应用淡豆豉来调整小鼠肠道菌群，结果表明可以纠正林可霉素造成的菌群失调，增加肠道有益菌双歧杆菌和乳酸杆菌的数量，为理想的微生态调节剂。尤其是纯种发酵淡豆豉，由于在发酵过程中避免了杂菌的污染，效果与丽珠肠乐相差不大，我们将在后续实验中对其有效成分进行提取和机制研究，为进一步扩大淡豆豉的应用范围提供依据。　　参考文献　　[1] 梁立春，王跃新，崔国利，等. 黄瓜香水、醇提取液对肠道菌群的调整作用的比较[J].中国微生态学杂志，2010，22（11）：998-1000　　[2] 蔡琨，冯华，田维毅.纯种发酵对淡豆豉主要有效成分的影响[J].甘肃中医学院学报，2006，23（5）：39-41　　[3] 胡新俊，李春香，王广，等.马齿苋多糖对肠道微生态失调小鼠的调整作用研究[J].中国微生态学杂志，2010，22（9）：781-783　　[4] 杨景云.医用微生态学[M].北京：中国医药科技出版社，1997：233-244