用G418建立稳定细胞系
03-30
实验步骤1
1. 转染:
用CHO或者N2a细胞转染BACE-HA后培养48小时,到细胞增长接近汇合时按1:4密度传代,继续培养,待细胞密度增至50%~70%汇合时;
2. 加G418:
去掉培养液,PBS洗一次,加入浓度为800ug/ml的G418筛选培养基。
3. 换液:
根据培养基的颜色和细胞生长情况,每3~5天更换一次筛选培养基。当有大量细胞死亡时,可以把G418浓度减半维持筛选。 筛选10~14天后,可见有抗性的克隆出现,停药培养,待其逐渐增大后;
4. 挑单克隆:
制备细胞悬液,细胞计数,用培养基稀释细胞到1个/5ul。在96孔板中加入培养基150ul/孔,再加入细胞悬液5ul/孔。待其逐渐增大后转入到48孔中增殖。
5. 单克隆鉴定:
细胞大量扩增后,同时用原细胞系转染PCDNA3.1,并设置对照组即空白对照,提蛋白,做western blot检测。
实验步骤2
1. 将处于对数生长期的CHO或者N2a细胞按比例接种于12孔板,待细胞长到60%时转染。转染方法同瞬时转染。
2. 待24-48小时后换为含800ug/mlG418的选择性培养基,将细胞按1:10稀释后稳定培养两周换为含600ug/mlG418的选择培养基
3. 将混合细胞吹打成单细胞悬浮计数,调整细胞数为每孔20个/孔, 加入100ul含200ug/mlG418的选择培养基,待抗性克隆长出后挑选良好的克隆,逐步放大,压力由含200ug/mlG418的培养基增加至含800ug/mlG418的培养基继续筛选,最后稳定用含800ug/mlG418培养基培养。