酪氨酸血症Ⅰ型的临床和基因突变分析

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目录Ｙ２７０１８１７

酪氨酸血症Ｉ型临床及基因突变分析

中英文缩写对照……………………………………………………………………０１中文摘要……………………………………………………………………………０２英文摘要……………………………………………………………………………０３正文

前言…………………………………………………………………………………０５日Ｕ晶…………………………………………………………………………………Ｕ５研究对象和方法……………………………………………………………………０６结果…………………………………………………………………………………１４讨论…………………………………………………………………………………２１参考文献……………………………………………………………………………２４综ｊ苤…………………………………………………………………………………２７致谢…………………………………………………………………………………３３

中英文缩写对照

常染色体隐性遗传ａｕｔｏｓｏｍａｌ

聚合酶链反应ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ

基因突变ｇｅｎｅｍｕｔａｔｉｏｎ

错义突变ｍｉｓｓｅｎｓｅ

无义突变ｎｏｎｓｅｎｓｅｍｕｔａｔｉｏｎｍｕｔａｔｉｏｎ

ｍｕｔａｔｉｏｎｒｅｃｅｓｓｉｖｅｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）纯合突变ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ

杂合突变ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓｍｕｔａｔｉｏｎ

特定位置独立计数得分ｐｏｓｉｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ

单核苷酸多态性ｓｉｎｇｌｅ

串联质谱法ｔａｎｄｅｍｎｕｃｌｅｏｆｉｄｅｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｏｕｎｔｓ（ＰＳＩＣ）ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＳＮＰ）ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＭＳ／ＭＳ）

气相色谱．质谱ｇａｓｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｙ—ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＧＣ－ＭＳ）

酪氨酸血症ｔｙｒｏｓｉｎｅｍｉａｔｙｐｅ１（ＨＴｌ）

延胡索酸乙酰乙酸水解酶ｆｕｍａｒｙｌａｃｅｔｏａｃｅｔａｔｅｈｙｄｒｏｌａｓｅ（ＦＡＨ）

甲胎蛋白ａｌｐｈａ－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＦＰ）

琥珀酰丙酮ｓｕｃｃｉｎｙｌａｃｅｔｏｎｅ

新生儿肝内胆汁淤积症ｎｅｏｎａｔａｌ

希特林蛋白缺陷Ｃｉｔｒｉｎｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ

Ｄａｔａｂａｓｅ人类基因突变数据库ＨｕｍａｎＧｅｎｅＭｕｔａｔｉｏｎ

单核苷酸多态性数据库Ｄａｔａｂａｓｅ

腹泻ｄｉａｒｒｈｅａ

佝偻病ｒｉｃｋｅｔｓＳｉｎｇｌｅＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ（ｄｂＳＮＰ）

尼替西农２．（２．ｎｉｔｒｏ－４．ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｙｌ）．１，３．ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｄｉｏｎｅ（ＮＴＢＣ）

中文摘要

目的分析３例酪氨酸血症Ｉ型患儿的临床及致病基因突变。方法按照国际罕见病组织提出的酪氨酸血症Ｉ型诊断标准回顾性的收集了３例患儿临床资料，采用ＰＣＲ直接测序技术对ＦＡＨ基因的１４个外显子及邻近１００ｂｐ的片段进行测序，运用ＢｉｏＥｄｉｔ软件读取测序图并人工核对；运用ＮＣＢＩＢｌａｓｔ工具与ＮＣＢＩ提供的基因组序列比对，搜索千人基因组或ｄｂＳＮＰｌ３７数据库，除外已知的ＳＮＰ位点。发现突变后在父母中进行突变的验证，ＣｌｕｓｔａｌＸ软件分析物种间ＦＡＨ酶的同源性。Ｐｏｌｙｐｈｅｎ软件通过计算特定位置独立计数得分（ＰＳＩＣ）预测错义突变的意义，ＰＳＩＣ＜０．５时为非致病突变；Ｏ．５＜ＰＳＩＣ茎１．５，根据氨基酸改变位点性质及改变后氨基酸类型的不同而判断；１．５＜ＰＳＩＣ＿＜２，有可能为致病突变；ＰＳＩＣ＞２，为致病突变。结果例ｌ，男，５个月２１天，迁延性腹泻，肝脾肿大、移动性浊音，甲胎蛋白＞１２１０¨ｇ／Ｌ，血酪氨酸１１０．８ｇｍｏｌ／Ｌ，尿琥珀酰丙酮８３．７ｌａｍｏｌ／Ｌ，同胞中姐姐因慢性腹泻就诊，疑诊为酪氨酸血症Ｉ型。第５外显子的４５５位碱基鸟嘌呤Ｇ变为腺嘌呤Ａ（ｃ．４５５Ｇ＞Ａ），导致在１５２位形成终止密码子（Ｗ１５２Ｘ），第１２外显子１０２７位碱基鸟嘌呤Ｇ变为腺嘌呤Ａ（ｃ．１０２７Ｇ＞Ａ），导致第３４３位氨基酸由甘氨酸变为精氨酸（Ｗ

来源于母亲，即ｃ．４５５Ｇ＞Ａ／ｃ．１０２７３４３Ｒ），ｃ．４５５Ｇ＞Ａ来源于父亲，Ｃ．１０２７Ｇ＞ＡＧ＞Ａ复合杂合突变。例２，女，６岁１个月，晚发型佝偻病起病，身高及体重在同龄儿第３百分位以下，肝脾肿大，串珠肋、手足镯、双膝向右弯曲，血磷０．５４ｍｍｏｌ／Ｌ，血钙２．４１ｍｍｏｌ／Ｌ，碱性磷酸酶１６２０ＩＵ／Ｌ，甲胎蛋白４１２．８ｕ∥Ｌ，血酪氨酸８３５．８ｇｍｏｌ／Ｌ，尿琥珀酰丙酮２７．４８ｐ．ｍｏｌ／Ｌ，钙剂及维生素Ｄ３治疗无效。患儿外祖父母为近亲婚配。在第１２外显子存在ｃ．１０２７Ｇ＞Ａ纯合突变，父母均为Ｃ０１０２７Ｇ＞Ａ杂合突变携带者。ＣｌｕｓｔａｌＸ预测ｃ．１０２７Ｇ＞Ａ突变为高度保守性突变，Ｐｏｌｙｐｈｅｎ软件计算突变的ＰＳＩＣ得分为３．２３５，为致病突变。例３，男，２岁４月，因间断性发热伴吐泻而发现肝脏肿大就诊，血磷Ｏ．５１ｍｍｏｌ／Ｌ，

５４３．２６碱性磷酸酶６２８ＩＵ／Ｌ，甲胎蛋白１１３６斗∥Ｌ，血酪氨酸ｇｍｏｌ／Ｌ，尿琥珀酰丙酮３２．３５ｇｍｏｌ／Ｌ，反复扩增外显子１均未成功。结论酪氨酸血症Ｉ型忠儿可以以迁延性腹泻或晚发型佝偻病起病，有肝脏肿大，难以纠正的低磷血症，甲胎蛋白明显升高，家族史或近亲婚配史为患病高危因素，尿琥珀酰丙酮检测有确诊意义，ＦＡＨ基因发生ｃ．４５５Ｇ＞Ａ和ｃ。１０２７Ｇ＞Ａ突变可以导致酪氨酸血症Ｉ型，例３的ＦＡＨ基因外显子１反复扩增不成功，推测可能为大片段缺失突变。

【关键词】酪氨酸血症：腹泻；佝偻病；ＤＮＡ突变分析：质谱分析；

复旦大学硕士论文

英文摘要

ＣｌｉｎｉｃａｌａｎｄｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆＣｈｉｎｅｓｅｃｈｉｌｄｒｅｎｗｉｔｈ

ｔｙｒｏｓｉｎｅｍｉａｔｙｐｅＩ

［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ

ｇｅｎｅＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌｆｅａｔｕｒｅｓａｎｄＦＡＨＣｈｉｎｅｓｅｃｈｉｌｄｒｅｎｗｉｔｈｔｙｒｏｓｉｎｅｍｉａｔｙｐｅＩ．ｍｕｔａｔｉｏｎｓｏｆｔｈｒｅｅ

ＩｎａｃｃｏｒｄａｎｃｅＭｅｔｈｏｄｗｉｔｈｔｈｅｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｃｒｉｔｅｒｉａｐｒｏｖｉｄｅｄｂｙｔｈｅ

ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｆｏｒＲａｒｅＤｉｓｏｒｄｅｒｓ，Ｃｌｉｎｉｃａｌｒｅｃｏｒｄｓｏｆｃａｓｅｓｔｈｒｅｅｗｅｒｅｒｅｖｉｅｗｅｄ．ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡｗａｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓｗｉｔｈＱＩＡａｍｐ⑩ＤＮＡＭｉｎｉ

ｅｘｏｎｓＫｉｔ．Ｔｈｅｐａｔｉｅｎｔｓｗｅｒｅｓｕｂｊｅｃｔｅｄｏｆｔｏｄｉｒｅｃｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ１４ｔｏｇｅｔｈｅｒｗｉｔｈｌＯＯｂｐａｄｊａｃｅｎｔｆｒａｇｍｅｎｔｓ

ＦＡＨｇｅｎｅｕｓｉｎｇＡＢＩＰｒｉｓｍ３７３０Ｇｅｎｅｔｉｃ

ＦｏｓｔｅｒＡｎａｌｙｚｅｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＣｉｔｙ，ＣＡ）ａｆｔｅｒＰＣＲｂａｓｅｄｏｎｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ．ＴｈｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｍａｐｗｅｒｅｍａｎｕａｌｌｙａｎａｌｙｚｅｄｂｙＢｉｏＥｄｉｔｓｏｆｔｗａｒｅａｎｄａｌｉｇｎｅｄｗｉｔｈｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｂｙＰｕｂｍｅｄＢｌａｓｔｔｏｏｌｆｏｒｅｘｃｌｕｄｉｎｇｋｎｏｗｎＳＮＰｌｏｃｉｂｅｆｏｒｅ

ｓｏｕｒｃｅｓｅａｒｃｈｉｎｇ１０００９ｅｎｏｍｅｓｄａｔａｂａｓｅｗａｓｖｅｒｉｆｉｅｄｂｙｏｒｄｂＳＮＰ１３７．Ｔｈｅｍｕｔａｔｉｏｎｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｔｏａｎａｌｙｚｉｎｇｐａｒｅｎｔｓ’ｅｘｏｎｓ

ｐａｔｉｅｎｔｓ’ｍｕｔａｔｉｏｎｅｘｏｎｓ．ＴｈｅｈｏｍｏｌｏｇｙｂｅｔｗｅｅｎｈｕｍａｎＦＡＨｅｎｚｙｍｅａｎｄｔｈａｔｏｆｏｔｈｅｒｓｐｅｃｉｅｓｗａｓｓｕｒｖｙｅｄｕｓｉｎｇｓｏｆｔｗａｒｅＣｌｕｓｔａｌＸ（ＥｕｒｏｐｅａｎＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｈｉｎｘｔｏｎ，ＳａｆｆｒｏｎＷａｌｄｅ，ｔｍ）．Ｐｏｌｙｐｈｅｎ（ＰｏｌｙｍｏｒｏｐｈｉｓｍＰｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ），ａｖａｉｌａｂｌｅｏｎｌｉｎｅ，ｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｐｒｅｄｉｃｔｐｏｓｓｉｂｌｅｉｍｐａｃｔｏｆａｎａｍｉｎｏａｃｉｄｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＦＡＨｅｎｚｙｍｅ．Ｐｏｌｙｐｈｅｎｃａｌｃｕｌａｔｅｓｐｏｓｉｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｏｕｎｔｓ（ＰＳＩＣ）ｓｃｏｒｅｓｆｏｒ

ＡＰＳＩＣｓｃｏｒｅｓｔｗｏａｍｉｎｏａｃｉｄｖａｒｉａｎｔｓｉｎｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｐｏｓｉｔｉｏｎ．ａｓｔｈａｔｄｉｆｆｅｒｂｙ＞２ｗｅｒｅｒｅｇａｒｄｅｄｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈｅｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙｏｆｄａｍａｇｉｎｇｖａｒｉａｎｔｓ，ＰＳＩＣＳ０．５ｎｏｎ—ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｍｕｔａｔｉｏｎ；０．５＜ＰＳＩＣ≤１．５，ｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｉｓｊｕｄｇｅｄｆｒｏｍｎａｔｕｒｅｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓ；１．５＜ＰＳＩＣ≤２，ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｙｏｆｄｉｓｅａｓｅ—ｃａｕｓｉｎｇｍｕｔａｔｉｏｎｓ；ＲｅｓｕｌｔＰａｔｉｅｎ１ｗａｓａ５ｍｏｎｔｈｓａｎｄ２１ｄａｙｓｏｌｄｂｏｙｗｈｏｓｕｆｆｅｒｅｄｆｒｏｍｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔｄｉａｒｒｈｅａ，ｈｅｐａｔｏｍｅｇａｌｙ，ａｓｃｉｔｅｓ；Ａｌｐｈａｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ＞１２１０ｐｇ／Ｌ，ｌｅｖｅｌｓｏｆｔｙｒｏｓｉｎｅｉｎｂｌｏｏｄａｎｄｓｕｃｃｉｎｙｌａｃｅｔｏｎｅ

ｓｕｆｆｅｒｅｄｉｎｕｒｉｎｅｗｅｒｅ１１０．８ｇｍｏｌ／Ｌａｎｄ８３．７ｐｍｏｌ／Ｌ．Ｈｉｓ

Ｉ．ＤｉｒｅｃｔｓｅｑｕｅｏｃｉｎｇｓｈｏｗｅｄａｓｉｓｔｅｒｆｒｏｍＴｙｒｏｓｉｎｅｍｉａｔｙｐｅＧｔｏＡｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｉｎＣＤＳｐｏｓｉｔｉｏｎ４５５ａｎｄ气

１０２７．ＨｅＩＳｃｏｍｐｏｕｎｄｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓｆｏｒｔｈｅｍｕｔａｔｉｏｎｃ．４５５Ｇ＞Ａ／ｃ．１０２７

ａＧ＞Ａ，ｗｈｉｃｈｐｒｅｄｉｃｔｓ

ｉ５２（Ｗ１ｃｈａｎｇｅｆｒｏｍｔｒｐｔｏｐｈａｎｔｏａｓｔｏｐｃｏｄｏｎａｔｐｏｓｉｔｏｎ５２Ｘ），ａｎｄ

ｒｉｃｋｅｔｓａｃｈａｎｇｅｆｒｏｍ２ｗａｓｇｌｙｃｉｎｅｔｏａｒｇｉｎｉｎｅａｔｐｏｓｉｔｉｏｎ３４３ａｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ（Ｗ３４３Ｒ）．Ｐａｔｉｅｎｔｌａｔｅ－ｏｎｓｅｔｗｈｏ６－ｙｅａｒａｎｄ１－ｍｏｎｔｈｏｌｄｇｉｒｌｗｉｔｈｈａｄｓｉｇｎｓｏｆｈｅｐａｔｏｓｐｌｅｎｏｍｅｇａｌｙ，ｒａｃｈｉｔｉｃ

ａｎｄａｌｋａｌｉｎｅｂｏｎｅｓ，ｗｉｎｄｓｗｅｐｔｋｎｅｅｓ．ＨｙｐｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｍｉａＯ．５４ｍｍｏｌ／Ｌ

ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ１６２０ＩＵ／Ｌｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ｎｏｒｍａｌｓｅｒｕｍｃａｌｃｉｕｍ．Ａｌｐｈａｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ４１２．８鹏几，ｌｅｖｅｌｓｏｆｔｙｒｏｓｉｎｅｉｎｂｌｏｏｄａｎｄｓｕｃｃｉｎｙｌａｃｅｔｏｎｅｉｎｕｒｉｎｅｗｅｒｅ８３５．８ｐｍｏｌ／Ｌａｎｄ２７．４８ｌｘｍｏｌ／Ｌ．Ｒｉｋｅｔｓｄｉｄｎｏｔｉｍｐｒｏｖｅａｆｔｅｒ

ａｎｄａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｃａｌｃｉｕｍｖｉｔａｍｉｎｅＤ３．Ｈｅｒｇｒａｎｄｐａｒｅｎｔｓａｒｅ

ｉｎｔｅｒｍａｒｒｉｇｅ．Ｓｈｅｉｓｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓｆｏｒｔｈｅｍｕｔａｔｉｏｎｃ．１０２７Ｇ＞Ａ，ｗｈｉｃｈｐｒｅｄｉｃｔｓＧ３４３Ｒ．Ｔｈｅｐａｒｅｎｔｓｗｅｒｅｍｕｔａｔｉｏｎｃａｒｒｉｅｒｓ．ＡｎａｌｙｓｉｓｂｙＣｌｕｓｔａｌＸｏｎｔｈｅａｌｉｇｎｍｅｎｔｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｒｅｓｉｄｕａｌｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎａｍｏｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔ

ａｍｉｎｏａｃｉｄｗａｓｈｉｇｈｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄ．ｓｐｅｃｉｅｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｌｏｃａｔｉｖｅ

ＰｏｌｙｐｈｅｎｓｏｆｔｗａｒｅｐｒｅｄｉｃｔＧ３４３Ｒｗａｓｐｒｏｂａｂｌｙｄａｍａｇｉｎｇ（ＰＳＩＣｓｃｏｒｅ３．２３５）．Ｐａｔｉｅｎｔ３，ａ２－ｙｅａｒ４－ｍｏｎｔｈｏｌｄｂｏｙ，ｗｈｏｓｅｃｈｉｅｆｃｏｍｐｌａｉｎｔｉｓｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔｆｅｖｅｒｗｉｔｈｖｏｍｉｔｉｎｇ

０．５１ａｎｄｄｉａｒｒｈｅａ，ｈａｄｈｅｐａｔｏｍｅｇａｌｙ，ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ６２８ＩＵ／Ｌ，

ｕｒｉｎｅＩａ＿ｙｐｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｍｉａａｌｐｈａ－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎｍｍｏｌ／Ｌ，ａｌｋａｌｉｎｅ１１３６岭／Ｌ，ｂｌｏｏｄｔｙｒｏｓｉｎｅ５４３．２６ｍｏｌ／Ｌ，

ｓｕｃｃｉｎｙｌａｃｅｔｏｎｅ３２．３５Ⅳｎｏｌ／Ｌ．Ｅｘｏｎｌｆａｉｌｓｔｏｂｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｅｄｒｅｐｅａｄｅｄｌｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ

ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓＦｏｒｏｆｃｈｉｌｄｒｅｎｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ

ｒｅｖｅａｌ

ａｎｄｗｉｔｈｄｉａｒｒｈｅａｔｙｒｏｓｉｎｅｍｉａｏｒｔｙｐｅＩｃａｎｈａｖｅｌａｔｅ—ｏｎｓｅｔｒｉｃｈｅｔｓ．ＰｈｙｓｉｃａｌｔｅｓｔｓｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎＣａｎｈｅｐａｔｏｍｅｇａｌｙ，ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｉｎｄｉｃａｔｅｏｆｈｙｐｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｍｉａｍａｒｋｅｄｌｙｅｌｅｖａｔｅｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ

ａｌｐｈａ－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎａｎｄａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｉｎｐｌａｓｍａａｎｄｓｕｃｃｉｎｙｌａｃｅｔｏｎｅｉｎｕｒｅａ，ｏｔｈｅｒｍｅｍｂｅｒｓｉｎｆａｍｉｌｙｍａｙｈａｖｅｔｙｒｏｓｉｎｅｍｉａｓｏｒｂｅｃｏｎｓａｎｇｕｉｎｅｏｕｓ，Ｍｕａｔｉｏｎｃ．４５５Ｇ＞Ａａｎｄｃ．１０２７Ｇ＞ＡＣａｎｂｅｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎＣｈｉｎｅｓｅｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＴｙｒｏｓｉｎｅｍｉａｔｙｐｅＩ．

［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］Ｔｙｒｏｓｉｎｅｍｉａｓ；Ｄｉａｒｒｈｅａ；Ｒｉｃｋｅｔｓ；ＤＮＡＭｕｔａｔｉｏｎ

Ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｕｍａｎａｌｙｓｉｓ；Ａｎａｌｙｓｉｓ；

４

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酪氨酸血症Ｉ型（ＨＴｌ，ＭＩＭ２７６７００）也称肝肾酪氨酸血症，是一种常染色体隐性遗传代谢性疾病。由编码延胡索酸乙酰乙酸水解酶（ｆｕｍａｒｙｌａｃｅｔｏａｃｅｔａｔｅｈｙｄｒｏｌａｓｅ，ＦＡＨ；ＥＣ３．７．１．２）的基因尉日突变引起，导致此酶的活性降低或缺乏，从而引起酪氨酸代谢产物及其衍生物在体内蓄积而引起一系列临床表现。此病根据发病年龄及预后分为急性型和慢性型，急性型多在６月龄前起病，表现为严重的肝脏疾病，往往以急性肝功能衰竭为主要表现就诊。慢性型多表现为慢性肝硬化，另外还表现为突出的肾小管疾病，如低磷血症佝偻病。如果不治疗，通常会在１０岁以前死亡。此外，约４０％的患儿会有神经危象，包括智力改变、腹痛、周围神经损害、伸肌张力增高、自残、膈肌麻痹甚至出现需要呼吸机支持的呼吸衰竭。其死亡的主要原因是肝衰竭、神经危象及肝细胞癌，但酪氨酸血症Ｉ型患者如果予以低酪氨酸饮食和ＮＴＢＣ联合治疗，生存率高达９０％，肝功能可得到改善，还可预防肝硬化、纠正肾小管酸中毒和继发性佝偻病。我国既往有关本病的报道，大多基于临床上存在反复黄疸、肝脏肿大、凝血功能异常及血串联质谱中血酪氨酸、蛋氨酸、瓜氨酸升高，尿气相质谱中４．羟基苯乙酸、４．羟基苯丙酮酸、４．羟基苯乳酸升高而诊断ｌｌ吲。然而，这些均非特异性表现，比如Ｃｉｔｒｉｎ缺陷导致的婴儿肝内胆汁淤积症（ＮＩＣＣＤ）ＨＩ及终末期肝病也会出现上述表现。也有文献报道，酪氨酸血症Ｉ型患者酪氨酸水平的检测甚至可以是正常的。以往报道的大多数病例未检测血或尿中的琥珀酰丙酮，更未进行基因诊断。现对２００７年４月．２０１２年４月就诊于复旦大学附属儿科医院的３例经尿琥珀酰丙酮确诊的酪氨酸血症Ｉ型患儿进行了详细的临床及基因突变分析。

研究对象和方法

一、研究对象

将符合国际罕见病组织提出的酪氨酸血症Ｉ型的诊断标准（ｈｔｔｐ：／／ｎｏｒｄ—ｐｈｙｓｉｃｉａｎｇ－ｕｉｄｅｓ．ｏｒｇ／ｔｙｒｏｓｉｎｅｍｉａ－ｔｙｐｅ－１／）纳入研究对像：

１．临床上有反复呕吐、腹泻或便血、皮肤易有淤斑或瘀点、嗜睡、易激惹伴肝肿大或腹水、胃肠出血的急性肝衰竭表现或与年龄及营养状况不符的佝偻病伴有肝肿大表现就诊的患儿

２．尿琥珀酰丙酮检测阳性

其中第２项为必选标准。

我们筛选了３例患儿，２例以反复腹泻就诊，１例以晚发型佝偻病就诊，３例患儿均有肝脏肿大，且尿琥珀酰丙酮检测为阳性。

临床病史：

例ｌ，男，５个月２ｌ天。因腹泻１个月，加重伴腹胀２天就诊。患儿入院前１个月出现腹泻，大便为黄色稀糊样，６．７次／天，量多，无特殊气味，一直以益生菌对症治疗，无好转，近２日腹泻加重，呈黄色水样泻，夜间每３小时一次，发现腹围渐增大，故来我院。患儿为第三胎第二产，足月顺产出生，出生体重３．８８埏；生后母乳及奶粉混合喂养。既往史：患儿生后曾因腹泻在当地医院门诊多次就诊。家族史：父母祖籍江苏，身体健康，非近亲婚配。母亲第一胎系社会因素流产，第二胎即患儿姐姐，因慢性腹泻在我院消化科就诊，住院期间存在难以控制的腹腔积液、凝血功能障碍、难以纠正的低磷血症、高碱性磷酸酶，丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、总胆红素、直接胆红素水平正常，查血串联质谱示酪氨酸明显升高，尿气相质谱示４．羟基苯乙酸、４．羟基苯乳酸异常升高，高度怀疑酪氨酸血症Ｉ型，后因多脏器功能衰竭（心、脑、肝脏、肺）死亡。

体格检查：体重９ｋｇ，身长６７ｃｍ，神志清，精神反应好，面容无殊，面部皮肤少许出血点，无黄染；心肺未见异常；腹部膨隆，移动性浊音（＋），肝肋下３５ｒｎｉｎ，脾肋下２０ｎｌｌｎ，质地韧；双下肢无水肿，四肢无畸形；神经系统无殊。

辅助检查：甲胎蛋１兰１＞１２１０ｐｇ／Ｌ，血串联质谱：酪氨酸１１０．８ｐｍｏｌ／Ｌ，尿气相质谱：４．羟基苯乳酸、４．羟基苯丙酮酸、４．羟基苯乙酸升高。尿琥珀酰丙酮８３．７ｐｍｏｌ／Ｌ。

诊断及治疗：根据尿琥珀酰丙酮明显升高，结合患几姐姐病史，临床诊断为酪氨酸血症Ｉ型。予特殊奶粉及持续素食饮食，尼替西农（ＮＴＢＣ）治疗６个月，２０１２年７月电话随访，患儿用药半年后大便己恢复正常，尿琥珀酰丙酮明显降

低，停药后半年时仍有间断性腹泻，复查尿琥珀酰丙酮上升。由于ＮＴＢＣ在国内还未批准应用，加之经济原因，家长未再用药，未再随访尿琥珀酰丙酮等。目前患儿大约每月发生鼻衄１次，身高９６ｃｍ（Ｐ２５．７５），体重１４ｋｇ（Ｐ２５．７５）。２０１３．３．４外院尿常规示尿蛋白阴性；血常规：血小板４４＂１０９／Ｌ，血红蛋白９８ｇ／Ｌ；腹部Ｂ超：肝左叶长３９ｍｍ，厚４２ｍｍ，右叶斜径１０５ｍｍ，肝脏缩小；包膜高低不平，边缘变钝，内部回声增强、增粗；肝静脉扭曲变细；门静脉内径约９ｍｍ，门静脉流速４７ｃｍ／ｓ；胰腺大小形态正常，内部回声均匀，主胰管正常，未见明显异常回声；脾脏大小１２５ｍｍ＊４８ｍｍ，形态饱满，包膜光滑完整，内部回声均匀；脾内未见明显异常回声；右肾大小约１１２ｍｍ＊４２ｍｍ，左肾大小约１１０ｍｍ＊４２ｍｍ，双肾形态正常，包膜完整，实质内部回声增强，集合系统无分离，双肾未见明显异常回声；腹腔可见游离无回声区，最大径约５２ｍｍ；左侧睾丸上方可见无回声区，呈梭状，大小６２ｍｍ＊２７ｍｍ；双侧睾丸，附睾形态大小如常，未见明显占位，ＣＤＦＩ：内部未见明显异常血流信号；超声意见：肝硬化，脾大，腹水，门静脉高压，双肾肿大，左侧精索鞘膜积液，双侧睾丸及附睾未见异常，胰未见明显占位。

例１姐姐，２月龄，因腹泻１月，病初发热２天入院，１月前患儿有反复的腹泻，大便为黄色稀糊样，６．８次／天，量时多时少，偶有血丝，病初有发热两天，服用对乙酰氨基酚后热退，在当地医院留观一夜，未见特殊，后一直中医调理，配合益生菌治疗，后出现腹胀，在当地查Ｂ超有腹腔积液，ｘ线示肠积气，血小板１０＊１０９／Ｌ，转诊至我院门诊查凝血功能异常，Ｂ超示腹腔内大量腹水，发病以来，吃奶尚可。体重不增。出生史：第二胎第一产，孕４０＋２周，顺产，出生体重４．２ｋｇ。

体格检查：神志清，反应可，腹围４６ｃｍ，头围３６ｃｍ，胸围３４ｃｍ，皮肤巩膜未见黄染，少许散在针尖样出血点，发育欠佳，营养欠佳，皮下脂肪＜Ｏ．４ｃｍ，心肺（．）。腹部膨隆，腹壁静脉显露，肝肋下２０ｍｍ，质软，脾未及，移动性浊音（＋），双下肢无水肿，四肢无畸形。

辅助检查：总胆红素１３．４ｇｍｏｌ／Ｌ，直接胆红素７．８

ＡＳＴ３８ｇｍｏｌ／Ｌ，ＡＬＴ２０ＩＵ／Ｌ，ＩＵ／Ｌ，碱性磷酸酶６８３ＩＵ／Ｌ，总蛋白３７．４ｇ／Ｌ，白蛋白１４．３ｇ／Ｌ，葡萄糖４．４ｍｍｏｌ／Ｌ，尿素１．０ｍｍｏｌ／Ｌ，肌酐２４Ｉ－ｔｍｏｌ／Ｌ，血清磷０．６１ｍｍｏｌ／Ｌ，血清钙１．９ｍｍｏｌ／Ｌ；总胆固醇２．８ｍｍｏｌ／Ｌ，甘油三酯０．４７ｍｍｏｌ／Ｌ，载脂蛋白Ａ０．４３∥Ｌ，载脂蛋白ＢＯ．４７∥Ｌ；凝血功能ＰＴ

Ｆｉｂ０．６ｇ／Ｌ，ＴＴ４３．９ｓ，ＰＴＡ１８％，ＩＮＲ４．７９，ＡＰＴＴ９４．３ｓ，３０ｓ；凝血因子：Ⅷ８７．１％，ＩＸ２２％，ＸＩ５０．３％，Ｖ７８．４％，ＶＩＩ５．５％，

ＩＩ６．１％，Ｘ１６．４％，Ｄ．Ｄ二聚体４．８８ｍｇ／Ｌ；肝纤维化四项：透明质酸＞８００ｇ／Ｌ（２．１００），ＩＶ型胶原５８９．９２ｇ／Ｌ（０．６４．７），层粘蛋白１３４．５ｇ／Ｌ（０．１３３），肝胆酸＞４０００ｇｇ／ｍｌ；腹水生化（．），找肿瘤细胞（．），腹水ＡＤＡ（．），腹水常规：白细胞总数５５个／ｍｍ３，腹水乳糜实验阴性，腹水培养阴性。肝筛、梅筛、ＨＩＶ抗体阴性；ＣＭＶｑｇＭ（＋），ＣＭＶｑｇＧ（＋），ＥＢＶ－ＩｇＭ（・），血ＣＭＶ－ＤＮＡ（一）、ＨＢＶ－ＤＮＡ（－）；甲状腺功能ＴＴ３４９．３

０．３０ｎｇ／ｄｌ，ＴＴ４３．１２ｇｇ／ｄｌ，ＦＴ３１．６８ｐｇ／ｍｌ，ＦＴ４０．８２ｎｇ／ｄｌ，ＴＳＨｕＩＵ／ｍｌ；ＣＤ系列：ＣＤ３＋８２％，ＣＤ４＋５３％，ＣＤ８＋２６％，ＣＤｌ９＋１０％，

１７ｇ／Ｌ，ＩｇＡ０．７８ｇ／Ｌ，ＩｇＭＣＤｌ６＋／ＣＤ５６＋７％，ＣＤ４＋／ＣＤ８＋２．０３：免疫球蛋白ＩｇＧ

２．１５∥Ｌ，Ｃ３０．２１ｇｍ，Ｃ４０．０８ｇ／Ｌ，ＣＨ５０４ＩＵ／ｍｌ，ＩｇＥ２６ＩＵ／ｍｌ；Ｃｏｏｍｂ’Ｓ实验（．）；血常规：白细胞５．３＂１０９／Ｌ，红细胞２．６４＂１０１２／Ｌ，血红蛋白８２９ｍ，血小板６１＂１０９／Ｌ，ＣＲＰ＜８ｍ／Ｌ；外周血涂片：淋巴细胞７８％，中性粒细胞８％，单核细胞１４％，Ｈｂ．Ｆ２８％（正常人：成人＜２％，新生儿７０．８０％，２－４个月降低，１岁左右接近成人）；骨髓穿刺增生骨髓象，巨核增生减低。尿气相质谱：４．羟基苯乙酸、４一羟基苯乳酸异常增高。血串联质谱：血酪氨酸１６８７．７３ｇｍｏｌ／Ｌ（１９—１２０），蛋氨酸７１１．１９ｇｍｏｌ／Ｌ（７．５８）、苯丙氨酸３２４．７５ｇｍｏｌ／Ｌ（２５．１２０）；甘氨酸１７５７．６５ｐ．ｍｏｌ／Ｌ（１１７．５５０），精氨酸７２．７３ｐ．ｍｏｌ／Ｌ（３．５．２０），血多种氨基酸均有升高，可能为蛋白质营养不良或肝功能严重紊乱所致。便常规：少许脂肪球。腹部Ｂ超：腹腔内大量积液，肝脾未见明显占位；胰腺未见占位；胆囊充盈不佳；总胆管未见局灶性扩张，肝静脉、门静脉、下腔静脉彩超示血流通畅。心超（．）。胸片右上肺渗出性病变。胃镜（十二指肠）：粘膜慢性炎症（轻到中度＋￣＋＋），粘膜下层内见散在扩张脉管。腹部ＣＴ腹腔内大量液体，胆囊腔增大，附见右下肺管状影。

诊断及治疗：由于未能做尿琥珀酰丙酮，根据病史怀疑为酪氨酸血症Ｉ型。入院后予输注凝血酶原复合物、白蛋白、冰冻血浆等，ＶｉｔＫｌ及止血敏，美能保肝，安体舒通、双氢克尿噻减轻水肿，中链脂肪酸奶粉喂养。后患儿突然无自主呼吸，无心跳，予心肺复苏后转入重症监护室，予机械通气治疗，家属放弃治疗，因多脏器功能衰竭死亡。

例２女，６岁１月，详细临床资料请参见文献‘５１，简述如下：因双下肢弯曲１年，跛行１月就诊；１年前出现双膝向右侧弯，在当地医院住院诊断为佝偻病，予钙剂、活性维生素Ｄ３治疗２个月无好转，后未再治疗，双下肢弯曲渐加重，近１个月行走中需多次休息，故来我院，家族史：父母祖籍江苏，体健，外祖父母近亲婚配；８

体格检查：身高／体重１０１．２ｃｍ／１５．１ｋｇ（＜Ｐ３），神志清，精神反应可，面容无殊，皮肤黏膜无黄染及瘀点瘀斑。肝肋下４ｃｍ，剑下３ｃｍ，脾肋下２ｃｍ，边缘锐，质地均韧，无触痛，移动性浊音阴性。串珠肋、手足镯、左膝内翻及右膝外翻畸形。

辅助检查：总胆红素９．６阻ｎｏｌ／Ｌ，直接胆红素３．７ｐ，ｍｏｌ／Ｌ，谷丙转氨酶１５ＩＵ／Ｌ，谷草转氨酶１８ＩＵ／Ｌ，碱性磷酸酶１６２０ＩＵ／Ｌ，丫．谷氨酰转肽酶８９ＩＵ／Ｌ，总蛋白６８．３∥Ｌ，白蛋白４７．７ｇ／Ｌ，血糖（空腹）４．５ｍｍｏｌ／Ｌ，血磷０．５４ｍｍｏｌ／Ｌ，甲胎蛋白４１２．８“ｇ／Ｌ，凝血酶原时间１４．６Ｓ，国际标准化比值１．１７，肝组织活检示肝纤维化伴轻度脂肪变性。血串联质谱：酪氨酸８３５．８ｇｍｏｌ／Ｌ，尿琥珀酰丙酮２７．４８ｇｍｏｌ／Ｌ。腹部Ｂ超：肝肿大，双。肾肿胀伴损害。

诊断及治疗：根据上述临床表现，临床诊断为酪氨酸血症Ｉ型。经济原因未进行药物治疗，嘱其持续低蛋白饮食治疗，己失访。

例３男，２岁４月，因发现肝肿大３月入院，生后洗澡时家长即发现其腹部较异卵双生的哥哥膨隆，且生后经常有吃奶后吐，非喷射性，无咖啡色液体，有反复腹泻，当时外院就诊，医生告知为正常现象，未在意，３月前因间断性发热伴吃后易吐，体温３８．３９℃左右，就诊于当地医院时发现肝脏肿大，故转诊于我院。家族史：患儿Ｇ１Ｐ２，足月，剖宫产（双卵双胎之小），生后无抢救及窒息史，生后经常有感冒、呕吐及腹泻史。０７年５月外院有腹股沟疝手术史。母亲儿时患过甲肝，父母非近亲结婚，家族中无类似病史。双卵双胎之哥哥体健。

体格检查：神志清，精神欠佳，反应可，浅表淋巴结无肿大，皮肤巩膜无黄染，心肺（．），腹膨隆，腹壁静脉显露，肝肋下３．５ｃｍ，剑下５ｃｍ，质地偏硬，脾肋下未及，移动性浊音（．），双下肢无浮肿，四肢无畸形，神经系统无殊。

辅助检查：总胆红素１１ｇｍｏｌ／Ｌ，直接胆红素５．１ｇｍｏｌ／Ｌ，谷丙转氨酶３７ＩＵ／Ｌ，谷草转氨酶５４ＩＵ／Ｌ，碱性磷酸酶６２８ＩＵ／Ｌ，１，．谷氨酰转肽酶２６１ＩＵ／Ｌ，总胆汁酸１．５｝ｔｍｏｌ／Ｌ，总蛋白６５．９ｇ／Ｌ，白蛋白４７．９ｇ／Ｌ，甲胎蛋白１１３６ｐ∥Ｌ，血糖４．２ｍｍｏｌ／Ｌ，甘油三脂１．８１ｍｍｏｌ／Ｌ，总胆固醇５．４２ｍｍｏｌ／Ｌ，载脂蛋白Ａｇ／Ｌ，载脂蛋白Ｂ１．０１Ｏ．９３ｇ／Ｌ，高密度脂蛋白０．８ｇ／Ｌ，低密度脂蛋白３．８４ｇｍ，尿酸

１３．２ｓ，ＰＴＡ１００％，１７５肛ｍｏｌ／Ｌ，尿素４．５ｍｍｏｌ／Ｌ，肌酐２０肛ｍｏｌ／Ｌ，凝血功能：ＰＴ

１ＮＲ１．０，ＡＰＴＴ４４．３ｓ，ＴＴ１６．７ｓ；铜蓝蛋白０．１２７ｇ／Ｌ，２４小时尿铜激发１１８８ｐｇ／２４ｈ尿铜；尿常规：白细胞８．１０／ＨＰ，红细胞３．５／ＨＰ，尿蛋白（＋），酮体（＋）；尿培养（．）；尿可滴定酸：ｐＨ６．５，ＨＣ０３．８ｍｍｏｌ／Ｌ，ＴＡ１５ｍｍｏｌ／Ｌ，ＮＨ４＋４１ｍｍｏｌ／Ｌ；心电图示：Ｉｏ房室传导阻滞；尿遗传代谢筛查：硝普钠反应（．），ＦｅＣｌ３反应（．），Ｂｕｐｒｉｇｏｎｅ反应和Ｂｅｎｅｄｉｃｔ反应（．），酸性白蛋白反应（．）；Ｂ超示肝肿大，肝损害，双肾肿胀伴损害，腹腔内淋巴结肿大，腹水（．）；腹部ＣＴ肝增

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大，未见局灶占位性病变；肝脏病理：相当于１０余个小叶范围，小叶结构破坏，弥漫性纤维增生伴个别假小叶形成，肝细胞广泛脂肪变性（大泡性），病变约占标本量的７０％左右，纤维间隔内无炎症反应，网状纤维和Ｍａｓｓｏｎ显示早期肝硬化，ＨｂｓＡｇ（－），ＨｂｃＡｇ（－），Ｃｏｐｐｅｒ（－），ＰｅｒｌｓＢｌｕｅ（－），ＰＡＳＤ（一），意见：肝硬化伴严重脂肪变性。血串联质谱：酪氨酸５４３．２６｝ｔｍｏｌ／Ｌ，其余氨基酸和肉碱未见异常；尿气相色谱：尿琥珀酰丙酮３２．３５ｇｍｏｌ／Ｌ、４．羟基苯乳酸、４．羟基苯丙酮酸和Ｎ．乙酰酪氨酸显著升高，结合血串联质谱血酪氨酸增高，诊断酪氨酸血症Ｉ型。

诊断及治疗：根据上述临床表现，临床诊断为酪氨酸血症Ｉ型，患儿已失访。

二、方法

１．标本的采集

经复旦大学附属儿科医院伦理委员会批准，经家属知情同意后采集患几及父母外周血细胞２ｍｌ，收集管采用ＥＤＴＡ抗凝管，收集后离心机离心分离血清及血细胞，分装Ｎ２个Ｂｕｆｆｅｒ管，并进行编号后，．８０℃冰箱保存。

２．试剂、试剂来源和仪器

血液基因组抽提试剂盒

２ｘＴａｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ上海天根生物有限公司

上海钰森生物有限公司

Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ５８０４Ｒａｐｐｅｎｄｏｒｆ琼脂糖离心机

ＰＣＲ引物

天能电泳仪

ＰＣＲ扩增仪

测序仪

托盘天平

移液器（规格：５９ｌ、２０９ｌ、１００９ｌ、２００９１）上海瑞安生物科技有限公司ＤＹＹ．ＩＩＩ型Ｂ１０．ＲＡＤＡＢｌ３７３０上海市第二天平仪器厂ａｐｐｅｎｄｏｒｆ

３．基因组ＤＮＡ的抽提：按血液基因组ＤＮＡ抽提试剂盒操作说明操作。提取前准备

ａ．５６。Ｃ水浴；５６。Ｃ预热ＴＥ（ＴＥ：１０ｍＭＴｒｉｓ．ＨＣｌ，０．１ｍＭＥＤＴＡ，０．２５％ＮａＮ３，ｐＨ８．０）

ｂ．ｊ各ＢｕｆｆｅｒＧＢ按照每次处理样品的数量枣Ｏ．４ｍｌ的体积分装到试剂盒携带的１５ｍｌ离心管中；将ＢｕｆｆｅｒＷＡＧ按照每次处理样品的数量宰０．５５ｍｌ的体积分装到试剂盒携带的１５ｍｌ离心管中；５６℃预热分装的ＢｕｆｆｅｒＧＢ和ＢｕｆｆｅｒＷＡＧ；使用结束后倒弃１５ｍｌ离心管中残留的试剂。

ｃ．５６℃预热Ｂｕｆｆｅｒ

裂解】０ＧＬ

（１）在干净的１．５ｍｌ离心管里用移液器加入１００“ｌ细胞＋ｌＯＯｐｌ生理盐水

（２））ＪＮ７ｋ２０ｉ．ｔｌ的蛋白酶Ｋ和２００ｕｌＢｕｆｆｅｒＧＬ，Ｖｏｒｔｅ震荡２０ｓ，置于５６。Ｃ水浴：水浴１０ｍｉｎ后，以同样的方式震荡一次，继续水浴５分钟。

（３）加入３５０肛１５６℃预热的ＢｕｆｆｅｒＧＢ，温和翻转离心管２０次，简短离心（离心速度达到３，０００＊ｇ后立即停止）去除离心管盖上的液体。

ＤＮＡ结合

（４）将步骤（３）中的溶液倒入ＤＮＡ吸附柱Ｃ．１５（置于收集管中），室温放置５ｍｉｎ。（５）７，０００９离一６，１ｍｉｎ，弃收集管，将ＤＮＡ吸附柱－Ｃ１５放入另一个干净的收集管中。

洗涤

（６）在ＤＮＡ吸附柱－Ｃ１５ｑｕ力ｌＬＸ．５００ｐｌ５６。Ｃ预热的ＢｕｆｆｅｒＷＡＧ，７，０００木ｇ离心１分钟，弃收集管，将ＤＮＡ吸附柱．Ｃ１５放入另外一个干净的收集管中。

（７）在ＤＮＡ吸附柱．Ｃ１５ｄＯ力［１，ｈ．５００ｐＪＢｕｆｆｅｒＷＢｌ，７，０００＊ｇ离心１分钟，弃废液，将ＤＮＡ吸附柱．Ｃ１５放回收集管中。

（８）重得步骤（７）

（９）１２，０００奉ｇ离一ｔ二，３ｍｉｎ。

洗脱

（１０）将ＤＮＡ吸附柱一Ｃ１５转入试剂盒携带的１．５ｍｌ离心管中，向硅胶膜的中央加入５０Ｉ＿ｔｌ５６。Ｃ预热的ＴＥ，将１．５ｍｌ的离心管的盖子扣在ＤＮＡ吸附柱上，做好标记，去除ＤＮＡ吸附柱的盖子。１２，０００＊ｇ３分钟，重复（１０）。．２０。Ｃ冰箱保存。４．２％琼脂糖凝胶电泳

（１）制备２％琼脂糖凝胶向锥形瓶内倒入浓度为０．５％ＴＢＥ液２５ｍｌ，将０．５９的琼脂糖粉放入锥形瓶内并摇匀，将ｌＯＯｍｌ量杯内装有２０ｍｌ水放入１００。Ｃ水浴箱内，将锥形瓶放入量杯内，３０分钟后取出锥形瓶，观察溶液为透明并且无絮状物后，加入２．５ｐｌＧｅｌｒｅｄ染料摇匀，稍冷却。

（２）胶板制备：

①取干净的有机玻璃槽

②用医用胶带将胶槽两端封好，将内槽置于水平位置，插好梳子。

③将稍冷却的琼脂糖凝胶液体小心地倒入胶槽里，使胶液慢慢展开（且勿快速倒入，以免形成空气泡，影响电泳结果），待胶槽铺满后，室温下放置１５分钟，凝胶将凝固，垂直的轻轻的拔下梳子，取下胶布，将凝胶放入电泳槽，电泳缓冲液１１

需要没过胶板为宜。

（３）加样：在薄膜塑料袋上混合ＤＮＡ样品和ＤＮＡ

样本＋０．５ｒｔｌＤＮＡＬｏａｄｉｎｇＬｏａｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ（３－４．５９ｌＤＮＡＢｕｆｆｅｒ），用２０山移液枪分别将ＤＮＡ样品加入琼脂凝胶的小孔内，每加新的样品，需更换新的枪头，避免ＤＮＡ样本间污染，加样时需垂直对好小孔，稍浸入ＴＥ液面下，缓慢打入样本，做好样本顺序的标记，同时力ｌＬＸ．１００ｂｐ的Ｌａｄｄｅｒ进行ＤＮＡ片段大小的确定，以确定为目的条带。

（４）电泳：插好电泳槽电源后，即可电泳，由于我们扩增的片段为５００ｂｐ左右，电压调节在１００Ｖ，ＤＮＡ样品会由负极泳向正极。停止电泳的时机我们选择在燃料距离加样孔约１ｃｍ处。

（５）观察：在紫外灯下观察扩增的ＤＮＡ（黄色荧光条带）与１００ｂｐＬａｄｄｅｒ的相对位置，确定是否为目的条带。

５．基因分析

（１）引物：设计并合成ＦＡＨ基因参与蛋白编码的１４个外显子及邻近上下游至少１００ｂｐ的序列（详见表１）。表１示扩增觑Ｈ基因１４个外显子的引物

（２）ＰＣＲ扩增

①反应体系：总体系３０ｕｌ，上游引物１肛ｌ、下游引物１山、２ｘＴａｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ１５９ｌ、模板ＤＮＡ２ｐｌ、ｄｄＨ２０ｌｌ肛１。

②反应条件：９５。Ｃ预变性１０ｍｉｎ，９４。Ｃ变性ｌｍｉｎ，６０．６２＂Ｃ退火ｌｍｉｎ，７２＂Ｃ延伸１ｍｉｎ，３０个循环；最后延伸７２＂Ｃ１０ｍｉｎ。

（３）ＰＣＲ产物纯化后用ＡＢＩ３７３０型测序仪进行直接测序。

６．序列分析：运用ＢｉｏＥｄｉｔ基因阅读软件读取测序图，由课题组双人进行人工核对；ＦＡＨ测序的序列运用Ｂｌａｓｔ工具与美国国家生物技术信息中心（ＮＣＢＩ）提供的基因组序列ＮＧ０１２８３３．１进行比对，并搜索千人基因组数据库（ｈｔｔｐ：／／ｂｒｏｗｓｅｒ．１０００９ｅｎｏｍｅｓ．ｏｒｇ／Ｈｏｍｏｓａｐｉｎｅｎｓ／Ｉｎｆｏ／Ｉｎｄｅｘ）或ｄｂＳＮＰｌ３７数据库，除外已知的ＳＮＰ位点。ＨＧＭＤ数据库查看有无突变位点报道。对存在可疑突变的外显子反向测序验证。ＰＣＲ扩增父母ＦＡＨ基因相应的外显子，进行测序验证。７．软件预测突变意义：ＣｌｕｓｔａｌＸ进行物种间序列比对，查看物种间ＦＡＨ酶的同源性及突变位点保守性，Ｐｏｌｙｐｈｅｎ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｂｗｈ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｐｐｈ／）软件预测氨基酸替换对ＦＡＩｌ酶结构及功能的影响。Ｐｏｌｙｐｈｅｎ通过计算特定位置独立计数得分（ｐｏｓｉｔｉｏｎ．ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｏｕｎｔｓ，ＰＳＩＣ）来评估两种氨基酸替换后致病的可能性。ＰＳＩＣ＜Ｏ。５时为非致病突变；０．５＜ＰＳＩＣ＜Ｉ．５，根据氨基酸改变位点性质及改变后氨基酸类型不同而判断；１．５＜ＰＳＩＣ＜２，有可能为致病突变；ＰＳＩＣ＞２，为致病突变【ｏ—Ｊ。

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结

一、临床特点归纳果

例ｌ及姐姐均以慢性腹泻就诊，加之姐姐有高度可疑的酪氨酸血症病史，就诊时我们只是进行了甲胎蛋白、血串联质谱及尿气相质谱检查，甲胎蛋白明显升高，酪氨酸水平正常，尿４．羟基苯乳酸、４．羟基苯丙酮酸、４．羟基苯乙酸明显升高，尿琥珀酰丙酮明显升高，经ＮＴＢＣ治疗有效。例２以晚发型佝偻病就诊，病程进展缓慢，难以纠正的低磷血症，血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、直接胆红素及凝血功能正常，腹部影像学示肝脾肾肿大，肝组织病理示肝纤维化伴轻度脂肪变性，血串联质谱示酪氨酸明显升高，尿４．羟基苯乳酸等明显升高，尿琥珀酰丙酮明显升高。例３以间断性发热伴吐泻就诊发现的肝脏肿大，值得注意的患儿生后有反复的吐泻史，甲胎蛋白明显升高，肝功能中天冬氨酸转氨酶轻度升高，胆红素水平正常，肝脏病理提示肝硬化伴严重脂肪变性，血酪氨酸明显升高，尿液中大量４．羟基苯乳酸、４．羟基苯丙酮酸，尿琥珀酰丙酮明显升高（表２为患儿的主要实验室检查）。

表２例１及姐姐、例２、例３主要实验室检查

二、基因测序结果

例１内含子１下游距离外显子２的第１３个碱基为鸟嘌呤Ｇ和腺嘌呤Ａ的杂１４